I denne protokollen beskriver vi valg og utarbeidelse av aktuelle celler for micromanipulation og bruk av en piezoelectric micromanipulator flytte kromosomer i disse cellene.
Micromanipulation av kromosomer har vært en viktig metode for å belyse mekanismen for kromosom congression, spindel checkpoint og anaphase kromosom bevegelser, og har vært nøkkelen til å forstå hva styrer kromosom bevegelser under en celledeling. En dyktig biolog kan bruke en micromanipulator koble kromosomene fra spindelen, flytte kromosomer i cellen, og bruke styrker kromosomene bruker en lite glass nål med veldig fine tips. Mens forstyrrelser kan gjøres til kromosomene ved hjelp av andre metoder som optisk overtrykk og andre bruker en laser, hittil, gjør ingen andre metoden reposisjonering av cellulære komponenter på omfanget av titalls til hundrevis av mikron med liten eller ingen skade på cellen .
Valg og utarbeidelse av relevante celler for micromanipulation av kromosomer, spesielt beskriver utarbeidelse av gresshoppe og cricket spermatocyte primære kulturer for bruk i live-celle bildebehandling og micromanipulation, er beskrevet her. I tillegg viser vi byggingen av en nål brukes for å flytte kromosomer i cellen og bruk av en joystick-kontrollerte piezoelectric micromanipulator med et glass nål tilknyttet flytte kromosomer i dele celler. Et utvalg resultat viser bruk av en micromanipulator koble et kromosom fra en spindel i en primær spermatocyte og flytte det kromosomet i cellen.
Micromanipulation har avdekket deler av mekanismen for et kromosom congression, spindel checkpoint og anaphase kromosom bevegelser. Tidligste publikasjonen som beskriver resultatene micromanipulation eksperimenter var Robert Chambers1. Chambers brukt en mekanisk micromanipulator med en vedlagt glass p for å undersøke cytoplasm i en rekke forskjellige celletyper. Dessverre var kontrast metoder som tillot visualisering av kromosomer, og mange andre cellulære komponenter i levende celler ikke tilgjengelig samtidig, så kamre eksperimenter ikke kan vise effekten av reposisjonering slik cellulære komponenter. Tidlig micromanipulations som endret kromosom posisjonen brukt Chambers apparatet for å feie spindel midzone i anaphase celler, viser at slike manipulasjoner kan endre plasseringen av kromosom armene i anaphase gresshoppe neuroblasts2 . Nicklas og hans medarbeidere var de første til å utføre fine micromanipulations av kromosomer, strekker seg kromosomene3, koble dem fra spindelen og indusere en nyorientering3,4, stabilisere en malorientation ved å bruke spenning til kromosomene5,6,7, og måle kreftene som er produsert av spindler i anaphase8,9. Annet arbeid av Nicklas lab viste at cytoplasmatiske granulater kan også være manipulert10 og at centrosomes kan flyttes av micromanipulation11. Micromanipulation er ikke bare nyttig for bevegelse kromosomer, og andre cellulære komponenter. En micromanipulation nål kan ren skjære gjennom et mitotisk spindel i demembranated celler12 eller kan brukes til å oppløse den kjernefysiske konvolutt13. I tillegg tilstøtende celler kan være smeltet sammen av micromanipulation14,15.
Med slik en rekke interessante eksperimenter som kan gjøres ved hjelp av micromanipulation, er det ved første øyekast overraskende at micromanipulation eksperimenter har blitt gjort av svært få kromosom biologer. En årsak til denne mangel er at de mitotically dele kulturperler cellene som er utledet fra virveldyr vev og brukes ofte for å studere kromosom bevegelser er svært vanskelig å micromanipulate. Disse vev kultur cellene har generelt en kortikale cytoskjelett at “blir i veien” av micromanipulation p, og kromosomene enten ikke kan nås gjennom nålen eller nålen sliper gjennom cellen, fører til en celle brudd og død. Vi, og andre forskere som bruker micromanipulation, har funnet leddyr cellene skal mottakelig for micromanipulation. Leddyr spermatocytes spres enkelt under et lag av halocarbon olje og virker en mye mindre robust kortikale cytoskjelett underliggende cellemembranen under en celledeling. Dermed leddyr testiklene gir en god kilde til meiotically-dele celler (spermatocytes) og mitotically-dele celler (spermatogonia) med lett tilgjengelig kromosomene for micromanipulation. En seriell snitting av en gresshoppe spermatocyte fast under en manipulasjon avslørt at nålen aldri trenger cellemembranen; cellemembranen deformerer rundt nålen (Nicklas R.B., personlig kommunikasjon). Spermatocytes fra en rekke insekter og edderkopp taxa har vært micromanipulated vellykket, inkludert gresshopper, be mantids, frukt fluer, crane fluer, gresshopper, spittlebugs, møll, sort enke edderkopper, kjelleren edderkopper og orb-veving edderkopper 3,7,17,18,19,20,21,22. Kultivert, mitotically-dele celler fra insekter kan være micromanipulated. For eksempel har kromosomene i gresshoppe neuroblasts i en primær kultur kromosomene som kan lett micromanipulated2,23. Vi mistenker at de tilgjengelige kultivert linjer fra Drosophila og andre insekter blir også micromanipulatable, men vi ikke har testet teknikken med disse cellene. Vi vil vise hvordan dele celler fra gresshopper og sirisser kan tilberedes for en micromanipulation. Gresshopper er lett å få fra høyst pet butikker til enhver tid av året. Gresshopper er bare lett oppnåelig sommeren med mindre forskeren har tilgang til laboratoriet kolonien, men arten brukes (Melanoplus sanguinipes) har lett sammenslåtte celler og lange, enkle å manipulere kromosomer.
En annen grunn til hvorfor micromanipulation eksperimenter har blitt gjort av en liten håndfull biologer er at micromanipulators som flytter kromosomene godt er sjelden tilgjengelig i markedet. Vi har funnet at en joystick-kontrollerte piezoelectric micromanipulator styrer nål bevegelsen uten vibrasjoner, drift, eller lag mellom joysticken bevegelsen og nål bevegelse, men andre typer manipulators kan også lykkes presse kromosomer rundt i cellen. Micromanipulators designet av Ellis og Begg25,26 er ideelle for micromanipulation av kromosomer, om de bruker eldre teknologi. Piezoelektriske micromanipulators er tilgjengelig og brukes ofte i elektrofysiologi; men er disse micromanipulators ikke vanligvis joysticken-kontrollert. Styrespak kontroll er nøkkelen til de jevne bevegelsene som kreves for en vellykket micromanipulation, og så en egendefinert joystick bør være konstruert å de aktuelle tilgjengelige piezoelectric micromanipulators arbeide for et kromosom micromanipulation. De joysticken-kontrollerte piezoelectric micromanipulators som fungerer best har direkte posisjon kontroll, hvor bevegelsen av joysticken oversettes direkte til en nål bevegelse.
En nydesignede piezoelectric micromanipulator kan konstrueres fra kommersielt tilgjengelig deler som kan lett erstattes og noen små 3D trykt komponenter, og det fungerer bra for kromosom micromanipulation24. Micromanipulator har justerbar følsomhet, manuell grov posisjonering, og ingen vibrasjoner, drift, eller lag i p bevegelse og direkte posisjon kontroll av nålen. Forskere kan konstruere micromanipulator bruke instruksjonene tilgjengelig online24. Nedenfor er metoder for å forberede en primær spermatocyte cellekultur og micromanipulating kromosomene i cellene i at kultur.
Med praksis kan bevegelse kromosomer i cellen bli andre natur. Nåler som er både tilstrekkelig stive og tilstrekkelig tynn-tipped er vanskelig å “få på grunn av” fabrikasjon, men dette også kommer med praksis. Pinne som er så bra at de deformere da flyttet i halocarbon olje vil ikke være nyttig for å skyve kromosomer i cellen. Pinne som er så sløv at deres tips er synlig og like stor som 1/3 av bredden på et kromosom (eller større) er svært sannsynlig å drepe cellen. Etableringen av en nål som er tilstrek…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Jessica Hall for sin verdifulle diskusjon.
VWR micro cover glass | VWR | 48366 249 | 25×25 mm, no 1.5 |
Dow Corning High Vacuum Grease | VWR | AA44224-KT | |
KEL-F Oil #10 | Ohio Valley Specialty Chemical | 10189 | |
Microdissecting Scissors, Stainless Steel | Sigma-Aldrich | S3271-1EA | |
Dumont #5 fine foreceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
0.85 mm outer diameter, 0.65 mm inner diameter Pyrex glass tube | Drummond Scientific | Custom order–call to request | |
Inverted, Phase contrast microscope with 10X or 16X low magnification objective and 60X or 100X high magnification objective | Any brand | ||
microforge | either custom built or Narashige | MF-900 | |
micromanipulator | either custom built or Burleigh PCS-6000 with custom piezo-controlling joystick | PCS-6300 |