Micromanipulation af kromosomer i insekt Spermatocytes

Summary

I denne protokol beskrive vi udvælgelse og forberedelse af passende celler til micromanipulation og brugen af en piezoelektriske micromanipulator flytte kromosomer i disse celler.

Abstract

Micromanipulation af kromosomer har været en vigtig metode til belysning af mekanismen til kromosom congression, spindel checkpoint og anaphase kromosom bevægelser, og har været nøglen til at forstå hvad styrer kromosom bevægelser under en celledeling. En dygtig biolog kan bruge en micromanipulator til at frigøre kromosomer fra spindel, flytte kromosomer i cellen og anvende styrker på kromosomer ved hjælp af et lille glas nål med en meget fin spids. Mens perturbationer kan stilles til kromosomer ved hjælp af andre metoder såsom optiske diffusering og andre anvendelser af en laser, til dato, tillader ingen anden metode Repositionering af cellulære komponenter på omfanget af snesevis til hundredvis af mikron med lidt at ingen skader på cellen .

Udvælgelse og forberedelse af passende celler til micromanipulation af kromosomer, der specifikt beskriver forberedelse af græshoppe og cricket spermatocyte primære kulturer til brug i live-celle imaging og micromanipulation, er beskrevet her. Derudover viser vi opførelsen af en nål til at bruges til at flytte kromosomer inden for cellen, og brug af en joystick-kontrollerede piezoelektriske micromanipulator med en glas nål knyttet til det for at flytte kromosomer inden for delende celler. En prøve resultatet viser brugen af en micromanipulator at løsne et kromosom fra en spindel i en primær spermatocyte og flytte kromosomet inden for cellen.

Introduction

Micromanipulation har afsløret dele af mekanismen for en kromosom congression, spindel checkpoint og anaphase kromosom bevægelser. De tidligste publikation der beskriver resultaterne af micromanipulation eksperimenter blev af Robert Chambers¹. Chambers anvendes en mekanisk micromanipulator med en vedhæftet glas nål for at sonde cytoplasmaet i en række forskellige celletyper. Desværre, kontrast metoder, der tillod visualisering af kromosomer og mange andre cellulære komponenter i levende celler var ikke tilgængelige på tidspunktet, så Chambers eksperimenter ikke kunne vise virkningerne af repositionering sådan cellulære komponenter. Tidlige micromanipulations, ændrede stillingen kromosom bruges apparatet kamre til at feje spindel midzone i anaphase celler, viser, at sådanne manipulationer kan ændre placeringen af kromosom arme i anaphase græshoppe neuroblasts² . Nicklas og hans medarbejdere var først til at udføre fine micromanipulations af kromosomer, stretching kromosomer³, løsrive dem fra spindel og inducere en nyorientering^3,4, stabilisere en malorientation ved at anvende spænding til kromosomer^5,6,7, og måle de kræfter, der er produceret af spindler i anaphase^8,9. Andet arbejde af Nicklas lab viste at cytoplasmatisk granulat kunne også være manipulerede¹⁰ og at centrosomes kunne flyttes af micromanipulation¹¹. Micromanipulation er ikke kun nyttig til at flytte kromosomer og andre cellulære komponenter. En micromanipulation nål kan rent skære igennem en mitotiske spindel i demembranated celler¹² eller kan bruges til at opløse de nukleare konvolut¹³. Derudover kan tilstødende celler være smeltet af micromanipulation^14,15.

Med sådan en bred vifte af interessante eksperimenter, der kan gøres ved hjælp af micromanipulation, det er ved første øjekast overraskende, at micromanipulation eksperimenter har gjort meget få kromosom biologer. En af grundene til denne mangel er, at de mitotically dividere kulturperler celler, der er afledt af hvirveldyr væv og er almindeligt anvendt til at studere kromosom bevægelser er meget vanskelige at micromanipulate. Disse vævskultur celler har generelt en kortikale cytoskeleton, “kommer i vejen” af micromanipulation nål, og kromosomer enten ikke kan nås af nålen eller nålen kværner gennem celle, fører til en celle brud og død. Vi og andre eksperimentatorer, der bruger micromanipulation, har fundet leddyr celler til at være åbne over for micromanipulation. Leddyr spermatocytes spredes nemt under et lag af halocarbon olie og synes at have en langt mindre robust kortikale cytoskeleton underliggende cellemembranen under en celledeling. Således leddyr testiklerne giver en god kilde til meiotically dividere celler (spermatocytes) og mitotically dividere celler (spermatogonia) med let tilgængelige kromosomer for micromanipulation. En seriel skæring af en græshoppe spermatocyte fast under en manipulation afslørede at nålen aldrig trænger cellemembranen; cellemembranen deformerer omkring nålen (Nicklas R.B., personlig meddelelse). Spermatocytes fra en række insekt og spider taxa har været micromanipulated med succes, herunder græshopper, bedende mantids, bananfluer, kran fluer, græshopper, spittlebugs, møl, sort enke edderkopper, kælder edderkopper og orb-vævning edderkopper ^{3,7,17,18,19,20,21,22}. Kulturperler, mitotically dividere celler fra insekter kan være micromanipulated. For eksempel, har kromosomer i grasshopper neuroblasts i en primær kultur kromosomer, der kan være let micromanipulated^2,23. Vi formoder, at de tilgængelige kulturperler linjer stammer fra Drosophila og andre insekter bliver også micromanipulatable, selvom vi ikke har testet teknik med disse celler. Vi vil vise, hvordan dividere celler fra græshopper og fårekyllinger kan være forberedt på en micromanipulation. Fårekyllinger er let at opnå fra de fleste dyrehandlere til enhver tid af året. Græshopper er kun let kan indhentes i sommeren, medmindre forskeren har adgang til et laboratorium koloni, men de arter, der anvendes (Melanoplus sanguinipes) har let fladtrykt celler, og lange, let at manipulere kromosomer.

En anden grund hvorfor micromanipulation eksperimenter har været udført af en lille håndfuld biologer er at micromanipulators at flytte kromosomer godt er sjældent tilgængelige på markedet. Vi har fundet, at en joystick-kontrollerede piezoelektriske micromanipulator styrer nålen bevægelse uden vibrationer, drift eller forsinkelse mellem bevægelsen joystick og nålen bevægelse, men andre typer af manipulatorer kan også med held skubbe kromosomer rundt i cellen. Micromanipulators designet af Ellis og Begg^25,26 er ideel til micromanipulation af kromosomer, selvom de bruger ældre teknologi. Piezoelektriske micromanipulators er i øjeblikket tilgængelige og er almindeligt anvendt i Elektrofysiologi; disse micromanipulators er imidlertid ikke typisk joystick-kontrolleret. Joystick kontrol er nøglen til de glatte bevægelser kræves for en vellykket micromanipulation, og så en brugerdefineret joystick bør konstrueres til at gøre de aktuelt tilgængelige piezoelektriske micromanipulators arbejde for et kromosom micromanipulation. De joystick-kontrollerede piezoelektriske micromanipulators, der fungerer bedst har direkte position kontrol, hvor bevægelse af joysticket kan oversættes direkte til en nål bevægelse.

En nyligt designet piezoelektriske micromanipulator kan konstrueres fra kommercielt tilgængelige dele, som kan udskiftes nemt og nogle små 3D-trykte komponenter, og det virker godt for kromosom micromanipulation²⁴. Micromanipulator har justerbar følsomhed, manuel groft positionering, og ingen vibrationer, drift, eller forsinkelse i nålen bevægelse og direkte position kontrol af nålen. Forskere kan konstruere micromanipulator ved hjælp af instruktionerne tilgængelige online²⁴. Nedenfor er metoderne til at forberede en primær spermatocyte cellekultur og for micromanipulating kromosomer i cellerne i denne kultur.

Protocol

1. forberedelse af primære insekt Spermatocyte cellekultur til Micromanipulation Skub forberedelse Opnå en 75 mm x 25 mm glas dias med en 20 mm diameter cirkulære hul skåret ud i midten af diaset.Bemærk: Disse blev skåret fra et blad af vinduesglas til at være på størrelse med et glas dias med et hul i midten. Køre en 25 mm x 25 mm #1.5 coverslip gennem en bunsenbrænder flamme for 2 s. Anvende vakuum fedt rundt i kanten af hullet i glas dias Sted coverslip…

Representative Results

Figur 6 viser en prøve micromanipulation af 2 tilstødende græshoppe primære spermatocytes i flere eksempler af de mulige anvendelser af micromanipulation. Dette forsøg blev gjort ved hjælp af en omvendt, fase-kontrast mikroskop. 0:00 (gange vist er i min:s) billede viser begge celler før manipulation. Et kromosom i cellen nederst er vist under spænding anvendes af micromanipulation nål (0:05; sort pil) og derefter helt løsrevet fra spindel (0:10; so…

Discussion

Med praksis, kan færdes kromosomer i cellen blive anden natur. Nåle, der er både tilstrækkeligt stive og tilstrækkelig tynd spids er svært at “få håndelag for” opdigte, men denne evne også kommer med praksis. Nåle, der er så fint at de deformeres når flyttede i halocarbon olie vil ikke være nyttigt for at skubbe kromosomer i cellen. Nåle, der er så afstumpede at deres tips er synlige og så store som 1/3 i bredden af et kromosom (eller større) er meget sandsynligt, at dræbe cellen. Oprettelsen af en nål…

Materials

VWR micro cover glass	VWR	48366 249	25×25 mm, no 1.5
Dow Corning High Vacuum Grease	VWR	AA44224-KT
KEL-F Oil #10	Ohio Valley Specialty Chemical	10189
Microdissecting Scissors, Stainless Steel	Sigma-Aldrich	S3271-1EA
Dumont #5 fine foreceps	Fine Science Tools	11254-20
0.85 mm outer diameter, 0.65 mm inner diameter Pyrex glass tube	Drummond Scientific	Custom order–call to request
Inverted, Phase contrast microscope with 10X or 16X low magnification objective and 60X or 100X high magnification objective	Any brand
microforge	either custom built or Narashige	MF-900
micromanipulator	either custom built or Burleigh PCS-6000 with custom piezo-controlling joystick	PCS-6300