गुणसूत्रों के Micromanipulation में कीट Spermatocytes
Summary
इस प्रोटोकॉल में, हम micromanipulation के लिए उपयुक्त कक्षों के चयन और तैयारी का वर्णन करते हैं और उन कक्षों के भीतर गुणसूत्रों का स्थान लेने के लिए एक piezoelectric micromanipulator का उपयोग करते हैं ।
Abstract
गुणसूत्रों के micromanipulation गुणसूत्र कांग्रेस, धुरी चौकी, और anaphase गुणसूत्र आंदोलनों के लिए तंत्र को रोशन करने के लिए एक अनिवार्य तरीका रहा है, और गुणसूत्र आंदोलनों नियंत्रण क्या समझ के लिए महत्वपूर्ण है एक कक्ष विभाजन के दौरान । एक कुशल जीवविज्ञानी एक micromanipulator का उपयोग करने के लिए धुरी से गुणसूत्रों अलग कर सकते हैं, सेल के भीतर गुणसूत्रों की स्थिति, और एक बहुत ही ठीक टिप के साथ एक छोटे गिलास सुई का उपयोग गुणसूत्रों के लिए बलों को लागू करने के लिए । जबकि perturbations इस तरह के ऑप्टिकल ट्रैपिंग और एक लेज़र के अंय उपयोगों के रूप में अंय तरीकों का उपयोग कर गुणसूत्रों के लिए बनाया जा सकता है, तारीख करने के लिए, कोई अंय तरीका सेल को कोई नुकसान के साथ माइक्रोन के सैकड़ों के लिए दसियों के पैमाने पर सेलुलर घटकों की स्थिति की अनुमति देता है .
गुणसूत्रों के micromanipulation के लिए उपयुक्त कोशिकाओं के चयन और तैयारी, विशेष रूप से टिड्डी और क्रिकेट spermatocyte प्राथमिक संस्कृतियों के लाइव सेल इमेजिंग और micromanipulation में उपयोग के लिए तैयारी का वर्णन है, यहां बताई । इसके अलावा, हम एक सुई के निर्माण के लिए सेल के भीतर गुणसूत्रों चलती के लिए इस्तेमाल किया जा दिखाने के लिए, और विभाजन कोशिकाओं के भीतर गुणसूत्रों की स्थिति के लिए यह करने के लिए संलग्न एक गिलास सुई के साथ एक जॉयस्टिक नियंत्रित piezoelectric micromanipulator का उपयोग करें । एक नमूना परिणाम एक micromanipulator का उपयोग एक प्राथमिक spermatocyte में एक धुरी से एक गुणसूत्र अलग करने के लिए और कक्ष के भीतर उस गुणसूत्र की स्थिति को दर्शाता है ।
Introduction
Micromanipulation एक गुणसूत्र कांग्रेस, धुरी चौकी, और anaphase गुणसूत्र आंदोलनों के लिए तंत्र के कुछ हिस्सों से पता चला है । जल्दी micromanipulation प्रयोगों के परिणामों का वर्णन प्रकाशन रॉबर्ट चेंबर्स1द्वारा किया गया । चैंबर्स एक यांत्रिक micromanipulator एक संलग्न गिलास सुई के साथ एक नंबर की कोशिका द्रव्य जांच करने के लिए इस्तेमाल किया विभिन्न प्रकार के सेल. दुर्भाग्य से, विपरीत तरीकों कि गुणसूत्रों और कई अंय जीवित कोशिकाओं में सेलुलर घटकों के दृश्य की अनुमति दी समय पर उपलब्ध नहीं थे, इसलिए ‘ चैंबर प्रयोगों ऐसे सेलुलर घटकों की स्थिति का प्रभाव नहीं दिखा सकता है । जल्दी micromanipulations कि गुणसूत्र स्थिति बदल मंडलों उपकरण इस्तेमाल के लिए anaphase कोशिकाओं में धुरी midzone झाडू, दिखा रहा है कि इस तरह के जोड़तोड़ anaphase टिड्डी neuroblasts 2 में गुणसूत्र हथियारों की स्थिति को बदल सकता है . Nicklas और उनके सहयोगियों के गुणसूत्रों के ठीक micromanipulations प्रदर्शन करने के लिए पहले थे,3गुणसूत्रों खींच, उन्हें धुरी से अलग और एक reorientation उत्प्रेरण3,4, एक स्थिर गुणसूत्रों5,6,7, और anaphase8,9में धुरी द्वारा उत्पादित बलों को मापने के लिए तनाव लागू करके malorientation । Nicklas लैब द्वारा अंय काम से पता चला कि cytoplasmic granules भी10 हेरफेर किया जा सकता है और कि centrosomes11micromanipulation द्वारा स्थिति हो सकती है । Micromanipulation गुणसूत्रों और अन्य सेलुलर घटकों को ले जाने के लिए सिर्फ उपयोगी नहीं है । एक micromanipulation सुई साफ कर सकते हैं demembranated कोशिकाओं12 में एक mitotic धुरी के माध्यम से कटौती या परमाणु लिफाफा13भंग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता. इसके अलावा, आसंन कोशिकाओं micromanipulation14,15से जुड़े हो सकते हैं ।
दिलचस्प प्रयोग है कि micromanipulation का उपयोग किया जा सकता है की इस तरह के एक विस्तृत विविधता के साथ, यह पहली नज़र में आश्चर्य की बात यह है कि micromanipulation प्रयोगों बहुत कुछ गुणसूत्र जीव द्वारा किया गया है । इस कमी के लिए एक कारण यह है कि mitotically-विभाजित प्रसंस्कृत कोशिकाओं है कि हड्डीवाला ऊतकों से प्राप्त कर रहे हैं और आमतौर पर गुणसूत्र आंदोलनों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं micromanipulate के लिए बेहद मुश्किल है. इन ऊतक संस्कृति कोशिकाओं को आम तौर पर एक cortical cytoskeleton कि “micromanipulation सुई के रास्ते में हो जाता है, और गुणसूत्रों या तो सुई से नहीं पहुंचा जा सकता है या सुई सेल के माध्यम से grinds, एक कोशिका टूटना और मौत के लिए अग्रणी । हम, और अन्य प्रयोगकर्ता जो micromanipulation का उपयोग करते हैं, सन्धिपाद कोशिकाओं को micromanipulation के लिए उत्तरदायी पाया है. सन्धिपाद spermatocytes आसानी से halocarbon तेल की एक परत के नीचे फैल रहे है और एक बहुत कम मजबूत cortical cytoskeleton एक कोशिका विभाजन के दौरान कोशिका झिल्ली अंतर्निहित है दिखाई देते हैं । इस प्रकार, सन्धिपाद परीक्षण spermatogonia के लिए आसानी से सुलभ गुणसूत्रों के साथ meiotically-विभाजन कोशिकाओं (spermatocytes) और mitotically-विभाजन कोशिकाओं (micromanipulation) का एक अच्छा स्रोत प्रदान करते हैं । एक सीरियल एक टिड्डी एक हेरफेर के दौरान तय spermatocyte के अनुभाग में पता चला कि सुई कोशिका झिल्ली प्रवेश कभी नहीं; कोशिका झिल्ली सुई के आसपास विकृतियों (Nicklas R.B., व्यक्तिगत संचार) । कीट और मकड़ी taxa की एक संख्या से Spermatocytes सफलतापूर्वक micromanipulated किया गया है, टिड्डे सहित, प्रार्थना mantids, फल मक्खियों, क्रेन मक्खियों, क्रिकेट, spittlebugs, पतंगे, काली विधवा मकड़ियों, तहखाने मकड़ियों, और गोला-बुनाई मकड़ियों 3,7,17,18,19,20,21,22। कल्चर्ड, mitotically-कीड़ों से कोशिकाओं को विभाजित कर micromanipulated जा सकता है. उदाहरण के लिए, टिड्डी neuroblasts में गुणसूत्रों एक प्राथमिक संस्कृति में गुणसूत्रों है कि आसानी से2,23micromanipulated जा सकता है । हमें संदेह है कि Drosophila और अन्य कीड़ों से प्राप्त उपलब्ध कल्चरल लाइनें भी micromanipulatable होंगी, हालांकि हमने इन कोशिकाओं के साथ तकनीक का परीक्षण नहीं किया है. हम बताएंगे कि कैसे टिड्डे और क्रिकेट से विभाजित कोशिकाओं को एक micromanipulation के लिए तैयार किया जा सकता है । क्रिकेट के लिए वर्ष के किसी भी समय सबसे पालतू दुकानों से प्राप्त करने के लिए आसान कर रहे हैं । टिड्डे गर्मियों में केवल आसानी से प्राप्य होते हैं जब तक शोधकर्ता के पास कोई प्रयोगशाला कॉलोनी तक पहुँच न हो, लेकिन इस्तेमाल की गई प्रजातियों (Melanoplus sanguinipes) में आसानी से कोशिकाओं को चपटा कर दिया जाता है, और लंबे, आसानी से छेड़छाड़ करने वाले गुणसूत्र होते हैं.
एक और कारण है कि micromanipulation प्रयोगों जीव की एक छोटी सी मुट्ठी भर से किया गया है कि micromanipulators कदम गुणसूत्रों अच्छी तरह से शायद ही बाजार में उपलब्ध हैं । हमने पाया है कि एक जॉयस्टिक नियंत्रित piezoelectric micromanipulator कोई कंपन, बहाव, या जॉयस्टिक आंदोलन और सुई आंदोलन के बीच अंतराल के साथ सुई आंदोलन को नियंत्रित करता है, लेकिन जोड़तोड़ के अन्य प्रकार भी सफलतापूर्वक गुणसूत्रों धक्का कर सकते हैं कक्ष में चारों ओर । एलिस और भीख25,26 द्वारा डिजाइन micromanipulators गुणसूत्रों के micromanipulation के लिए आदर्श होते हैं, हालांकि वे पुराने प्रौद्योगिकी का उपयोग करें । Piezoelectric micromanipulators वर्तमान में उपलब्ध है और आमतौर पर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी में इस्तेमाल किया; हालांकि, इन micromanipulators नहीं सामांयतया जॉयस्टिक-नियंत्रित हैं । जॉयस्टिक नियंत्रण एक सफल micromanipulation के लिए आवश्यक चिकनी आंदोलनों के लिए महत्वपूर्ण है, और इसलिए एक कस्टम जॉयस्टिक एक गुणसूत्र micromanipulation के लिए वर्तमान में उपलब्ध piezoelectric micromanipulators काम करने के लिए निर्माण किया जाना चाहिए । जॉयस्टिक नियंत्रित piezoelectric micromanipulators है कि सबसे अच्छा काम सीधे स्थिति नियंत्रण है, जिसमें जॉयस्टिक के आंदोलन एक सुई आंदोलन करने के लिए सीधे अनुवाद ।
एक नए डिजाइन piezoelectric micromanipulator व्यावसायिक रूप से उपलब्ध भागों है कि आसानी से और कुछ छोटे 3 डी मुद्रित घटकों से प्रतिस्थापित किया जा सकता से निर्माण किया जा सकता है, और यह24micromanipulation गुणसूत्र के लिए अच्छी तरह से काम करता है । micromanipulator समायोज्य संवेदनशीलता, मैनुअल मोटे स्थिति, और कोई कंपन, बहाव, या सुई आंदोलन में अंतराल, और सुई के प्रत्यक्ष स्थिति नियंत्रण है । वैज्ञानिकों उपलब्ध निर्देशों का उपयोग कर micromanipulator का निर्माण कर सकते है ऑनलाइन24। नीचे एक प्राथमिक spermatocyte सेल संस्कृति की तैयारी के लिए और उस संस्कृति में कोशिकाओं के भीतर गुणसूत्रों micromanipulating के लिए तरीके हैं ।
Protocol
Representative Results
Discussion
अभ्यास के साथ, चलती गुणसूत्रों कोशिका में चारों ओर दूसरा प्रकृति बन सकता है । सुइयों कि दोनों पर्याप्त कड़ी है और पर्याप्त रूप से पतली इत्तला दे दी है “के आदत प्राप्त” बनाना मुश्किल है, लेकिन यह क्षमता भी…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम उसे मूल्यवान चर्चा के लिए जेसिका हॉल धंयवाद ।
Materials
| VWR micro cover glass | VWR | 48366 249 | 25×25 mm, no 1.5 |
| Dow Corning High Vacuum Grease | VWR | AA44224-KT | |
| KEL-F Oil #10 | Ohio Valley Specialty Chemical | 10189 | |
| Microdissecting Scissors, Stainless Steel | Sigma-Aldrich | S3271-1EA | |
| Dumont #5 fine foreceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| 0.85 mm outer diameter, 0.65 mm inner diameter Pyrex glass tube | Drummond Scientific | Custom order–call to request | |
| Inverted, Phase contrast microscope with 10X or 16X low magnification objective and 60X or 100X high magnification objective | Any brand | ||
| microforge | either custom built or Narashige | MF-900 | |
| micromanipulator | either custom built or Burleigh PCS-6000 with custom piezo-controlling joystick | PCS-6300 |
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