Criblage à haut débit siARN préjudice de cellules épithéliales de chloropicrine et cornée induite par le fluorure d’hydrogène
Summary
Criblage de RNA inhibitrice petit haut débit est un outil important qui pourrait aider à élucider plus rapidement les mécanismes moléculaires des lésions épithéliales cornée chimique. Nous présentons ci-après, le développement et la validation des modèles d’exposition et des méthodes pour le criblage à haut débit de fluorure d’hydrogène et chloropicrine-cornée épithéliales lésion induite.
Abstract
Lésion oculaire induite par la substance toxique est une véritable urgence oculaire parce que les produits chimiques sont susceptibles d’infliger rapidement des lésions tissulaires importants. Traitements pour lésion de la cornée induite par la substance toxique sont généralement favorables car aucune thérapeutique spécifique n’existe pour soigner ces blessures. Dans les efforts pour développer des traitements et thérapies pour s’occuper de l’exposition, il peut être important de comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires de ces blessures. Nous proposons que l’utilisation de criblage à ARN (siRNA) inhibiteur petit haut débit peut être un outil important qui pourrait aider à élucider plus rapidement les mécanismes moléculaires des lésions épithéliales cornée chimique. siARN sont double brin molécules d’ARN qui sont 19-25 nucléotides de long et utilisent le silençage voie pour dégrader les ARNm de gènes post-transcriptionnels ayant une homologie avec le siARN. La réduction résultant de l’expression du gène spécifique peut alors être étudiée dans les cellules exposées toxiques pour déterminer la fonction de ce gène dans la réponse cellulaire à la substance toxique. Le développement et la validation des modèles d’exposition in vitro et des méthodes pour le haut débit (HTS) de dépistage de fluorure d’hydrogène (HF) et chloropicrine-(CP) induites par des blessures oculaires sont présentés dans cet article. Même si nous avons choisi ces deux des substances toxiques, nos méthodes sont applicables à l’étude des autres substances toxiques avec des modifications mineures au protocole exposition toxique. L’antigène de T grand SV40 immortalisé ligne de cellules épithéliales cornéennes humaines QUE SV40-HCEC a été sélectionné pour l’étude. La viabilité cellulaire et la production d’IL-8 ont été choisis comme points de terminaison dans le protocole de dépistage. Plusieurs défis associés au développement de l’exposition de produits toxique et les méthodes de culture cellulaire adaptés aux études HTS sont présentés. La création de modèles HTS pour ces substances toxiques permet pour d’autres études pour mieux comprendre le mécanisme de blessure et d’écran potentiel thérapeutique pour des lésions oculaires chimiques.
Introduction
Lésion oculaire induite par la substance toxique est une véritable urgence oculaire parce que les produits chimiques sont susceptibles d’infliger rapidement des lésions tissulaires importants. Malheureusement, les traitements pour lésion de la cornée induite par la substance toxique ne sont généralement favorables comme aucune thérapeutique spécifique n’existe pour soigner ces blessures. L’actuelle stratégie de traitement est non spécifique et comprend principalement des traitements thérapeutiques topiques tels que les lubrifiants, antibiotiques, et cycloplegics suivie d’anti-inflammatoires (par exemple, stéroïdes) une fois la cornée a re-epithelialized1 ,2. Malgré les meilleur traitement thérapeutique options actuelles disponibles, le pronostic à long terme est généralement médiocre en raison d’une opacification cornéenne progressive et une néovascularisation2,3.
Modèles animaux ont traditionnellement été utilisés pour étudier la toxicité chimique et comprendre les mécanismes des blessures. Cependant, les études chez l’animal sont fastidieux et coûteux. Il y a aussi des efforts pour réduire les essais sur les animaux. Par exemple, la législation REACH (EC 1907/2006) dans l’Union européenne a dispositions visant à réduire les essais sur les animaux. Les dispositions comprennent une exigence que compagnies de partagent des données afin d’éviter les animaux tests et obtenir l’approbation de l’Agence des produits chimiques avant d’effectuer les tests proposés sur les animaux. En vertu des dispositions du règlement REACH, l’expérimentation animale doit être un dernier recours. Il y a aussi la réglementation européenne de cosmétiques (ce 1223/2009) qui a éliminé les tests des cosmétiques chez les animaux. Lorsque des études chez l’animal sont effectués, ils sont guidés par les principes des 3R (raffinement, réduction et remplacement), qui établit un cadre pour effectuant des recherches sur les animaux plus humaine, ce qui réduit le nombre d’animaux utilisés et en utilisant des solutions de rechange non animale Lorsque c’est possible. Pour ces raisons, le domaine de la toxicologie a cherché à adopter les dosages in vitro qui permettent de mieux comprendre les mécanismes moléculaires de toxicité et peuvent se faire à plus haut débit4. Il s’agit d’une approche fonctionnelle de toxicologie où les substances toxiques sont définis par leur fonction, et non uniquement par leur composition chimique. Fait un pas de plus, fonctionnelle toxicogénomique cherche à comprendre le rôle que jouent les gènes spécifiques dans les effets des substances toxiques,5. Avec l’application de la technologie de siARN, écrans pour étudier la fonction des gènes dans les réponses moléculaires et cellulaires aux substances toxiques peuvent être faits à haut débit. siARN sont double brin molécules d’ARN qui sont 19-25 nucléotides qui profiter du post transcriptionnelle de gènes silencieux parcours présent dans toutes les cellules de mammifères,6. Celles-ci sont synthétiquement faits et conçus pour cibler un gène spécifique. Lorsque introduit dans une cellule, le siARN est traitée et un brin, le brin de guide, est chargé dans le complexe silencieux RNA-induced (RISC). Le siARN dirige le RISC à une région complémentaire dans une molécule d’ARNm et le RISC dégrade l’ARNm. Cela se traduit par la réduction de l’expression du gène spécifique. La réduction résultant de l’expression du gène spécifique peut alors être étudiée dans les cellules exposées toxiques pour déterminer la fonction de ce gène dans la réponse cellulaire à la substance toxique. Une telle approche a été utilisée afin de mieux comprendre les mécanismes de la susceptibilité de la ricine et l’induction de la procréation assistée dépendante du CYP1A17,8.
La liste de produits chimiques le terrorisme risque évaluation (CTRA) et les listes de produits chimiques industriels toxiques (TIC) ont détaillé certains produits chimiques basés sur leur toxicité et le potentiel d’être libéré au cours d’un terroriste, guerre ou accident industriel événement9. Nous appliquons un siARN criblage à haute approche toxicogénomiques (HTS) à l’étude de la CTRA liste des substances toxiques, qui ont été identifiés à risque élevé d’usage lors d’un incident terroriste. Toxicologie traditionnelle cherche à comprendre les effets indésirables ayant des produits chimiques sur les organismes vivants ; Cependant, nous avons un désir supplémentaire pour comprendre les mécanismes des blessures afin d’informer de la mise au point des thérapeutiques et des approches thérapeutiques et, éventuellement, à découvrir des molécules qui peuvent être ciblées pour le développement thérapeutique. Cet effort d’une certaine façon peut être considéré comme analogue à l’utilisation de siRNA criblage à haut débit et des essais sur des cellules de base dans la drogue découverte processus10. Une différence majeure est que la découverte de médicaments généralement cherche une cible du singulier pour la découverte thérapeutique alors que dans notre approche, il est assez improbable qu’il y aurait une cible du singulier à haute valeur thérapeutique pour le traitement de l’exposition toxique. Nous prévoyons que tout paradigme de traitement efficace pour l’exposition toxique nécessiterait une approche multi-facettes pour atteindre la haute valeur thérapeutique, et données toxicogénomiques peuvent informer vitale d’un paradigme de traitement efficace.
Benchtop automation apporte la méthodologie haut débit aux laboratoires en dehors de l’industrie pharmaceutique ou de biotechnologie. Les études in vitro à notre Institut ont été historiquement les dosages traditionnels qui sont de faible débit11,12,13. En quelques années, notre laboratoire est passée à l’utilisation de la robotique de benchtop pour effectuer des siARN criblage à haut débit. Nous présentons ici, le raffinement des modèles de cellules oculaires et le développement de in vitro des méthodes d’exposition à l’acide fluorhydrique (HF) et de la chloropicrine (CP) adapté aux siARN criblage à haut débit. Notre objectif est d’identifier des molécules qui régulent la lésion cellulaire en réponse à ces substances toxiques. Les objectifs de la bibliothèque de siARN, que nous avons sélectionné incluent les récepteurs couplés aux protéines G, protéines kinases, phosphatases, protéases, canaux ioniques et autres cibles potentiellement thérapeutiques. HF et le CP ont été sélectionnés pour l’étude en renvoyant les agents liste CTRA avec les rapports ToxNet des accidents industriels pour trouver ceux qui présentent le plus grand risque de blessure oculaire par vapeur exposition9,14. CP (formule chimique Cl3ONC2, numéro CAS 76-06-2) a été utilisé comme un gaz lacrymogène dans WWI15. Il est actuellement utilisé comme un fumigant agricole et fonctions comme un nématicide, fongicide et insecticide16. Fluorure d’hydrogène (HF) est utilisé dans les processus y compris alkylation dans les raffineries de pétrole et de la fluoration électrochimique de composés organiques17. HF (formule chimique HF, numéro CAS 62778-11-4) est un gaz, mais dans sa forme aqueuse est acide fluorhydrique (HFA numéro CAS 7664-39-3). Par conséquent, nous avons choisi d’utiliser HFA dans notre cellule en modèles d’exposition. L’antigène de T grand SV40 immortalisé ligne de cellules épithéliales cornéennes humaines QUE SV40-HCEC a été sélectionné pour l’étude. La viabilité cellulaire et les marqueurs inflammatoires IL-8 ont été choisis comme points de terminaison, parce que les cibles qui sont impliqués dans la lésion cellulaire devraient être reflétées dans la mort cellulaire et la réponse inflammatoire. Plus précisément, si une cible devait jouer un rôle protecteur dans l’exposition toxique, mort cellulaire et/ou la production de cytokines inflammatoires devrait augmenter lorsque l’expression cible est inhibée par les siARN. L’inverse serait vrai pour les cibles qui jouent un rôle négatif. En outre, inflammation chronique semble jouer un rôle dans la pathologie de la cornée après que exposition et intervention dans les voies de la mort cellulaire peuvent améliorer les résultats cliniques2,18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans les présentes, nous décrivons nos méthodes et nos résultats sur le développement d’une cellule épithéliale de haut débit cornée, modèle pour l’étude des lésions HF et CP de dépistage. Nous présentons aussi les résultats de l’écran de siARN primaires pour blessure de HF. Il y avait de nombreux défis pour le développement de modèles HTS pour l’étude des blessures TIC. Les méthodes que nous pourrions trouver dans la littérature concernant l’étude de HF, HFA ou CP dans les modèles de cu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été financée par le National instituts de santé contrecarrer programme interagences accord # AOD13015-001. Nous tenons à remercier Stephanie Froberg et Peter Hurst pour leurs efforts et leur expertise en matière de production vidéo.
Materials
| Bravo liquid handing platform | Agilent or equivalent | G5409A | |
| Bravo plate shaker | Agilent or equivalent | Option 159 | |
| Bravo 96LT disposable tip head | Agilent or equivalent | Option 178 | 96-channel large tip pipetting head unit |
| Bravo 96ST disposable tip head | Agilent or equivalent | Option 177 | 96-channel small tip pipetting head unit |
| Bravo 384ST disposable tip head | Agilent or equivalent | Option 179 | 384-channel small tip pipetting head unit |
| Bravo 96 250 μL sterile barrier tips | Agilent or equivalent | 19477-022 | |
| Bravo 384 30 μL sterile barrier tips | Agilent or equivalent | 19133-212 | |
| Bravo 384 70 μL sterile barrier tips | Agilent or equivalent | 19133-212 | |
| EnSpire multimode plate reader | Perkin Elmer or equivalent | 2300-0000 | AlphaLISA assay detector with high power laser excitation |
| IL-8 (human) AlphaLISA Detection Kit | Perkin Elmer or equivalent | AL224F | no-wash bead-based assay |
| ProxiPlate-384 Plus white 384-shallow well microplates | Perkin Elmer or equivalent | 6008359 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen or equivalent | 13778500 | Transfection reagent |
| Opti-MEM 1 Reduced Serum Medium | Invitrogen or equivalent | 31985070 | |
| TrypLE Express | Gibco or equivalent | 12605010 | Cell detachment solution |
| IncuCyte Zoom | Essen Instruments or equivalent | ESSEN BIOSCI 4473 | Incubator-housed automated microscope |
| Chloropicrin | Trinity Manufacturing or equivalent | N/A | Acute toxicity and irritant |
| DMEM-F12 cell culture medium | Invitrogen or equivalent | 11330-057 | Contains HEPES |
| Fetal bovine serum | Invitrogen or equivalent | 1891471 | |
| Human epidermal growth factor (cell culture grade) | Invitrogen or equivalent | E9644-.2MG | |
| Recombinant human insulin (cell culture grade) | Invitrogen or equivalent | 12585-014 | |
| Penicillin-Streptomycin solution (cell culture grade) | Invitrogen or equivalent | 15140122 | |
| Hydrocortisone (cell culture grade) | Sigma or equivalent | H0888-10G | |
| Glucose (cell culture grade) | Sigma or equivalent | G7021 | |
| PBS (cell culture grade) | Sigma or equivalent | P5493 | |
| siRNA | Dharmacon or equivalent | various | |
| Thiazolyl blue tetrazolium bromide | Sigma or equivalent | M5655 | MTT assay substrate |
| siRNA buffer | Thermo or equivalent | B002000 | |
| 96-well cell culture plates | Corning or equivalent | CLS3595 | |
| T150 cell culture flasks | Corning or equivalent | CLS430825 | |
| BSL-2 cell culture hood | Nuaire or equivalent | NU-540 | |
| 300 mL robotic reservoirs | Thermo or equivalent | 12-565-572 | |
| 96 baffled automation reservoirs | Thermo or equivalent | 1064-15-8 | |
| 500 mL sterile disposable storage bottles | Corning or equivalent | CLS430282 | |
| Microplate heat sealer | Thermo or equivalent | AB-1443A | |
| Microplate heat sealing foil | Thermo or equivalent | AB-0475 | |
| Cardamonin | Tocris or equivalent | 2509 | Anti-inflammatory, used as positive control |
| SKF 86002 | Tocris or equivalent | 2008 | Anti-inflammatory, used as positive control |
| DMSO | Sigma or equivalent | D8418 | |
| 48% hydrofluoric acid | Sigma or equivalent | 339261 | Corrosive and acute toxicity |
| 1000 μL Single channel pipettors | Rainin or equivalent | 17014382 | |
| 200 μL Single channel pipettors | Rainin or equivalent | 17014391 | |
| 20 μL Single channel pipettors | Rainin or equivalent | 17014392 | |
| 1000 μL 12-channel pipettors | Rainin or equivalent | 17014497 | |
| 200 μL 12-channel pipettors | Rainin or equivalent | 17013810 | |
| 20 μL 12-channel pipettors | Rainin or equivalent | 17013808 | |
| Pipettor tips 1000 μL | Rainin or equivalent | 17002920 | |
| Pipettor tips 200 μL | Rainin or equivalent | 17014294 | |
| Pipettor tips 20 μL | Rainin or equivalent | 17002928 | |
| Chemical fume hood | Jamestown Metal Products | MHCO_229 | |
| 384-well sample storage plates | Thermo or equivalent | 262261 | |
| Sodium chloride | Sigma or equivalent | S6191 | |
| 50 mL conical tubes | Thermo or equivalent | 14-959-49A | |
| Serological pipettes 50 mL | Corning or equivalent | 07-200-576 | |
| Serological pipettes 25 mL | Corning or equivalent | 07-200-575 | |
| Serological pipettes 10 mL | Corning or equivalent | 07-200-574 | |
| Serological pipettes 5 mL | Corning or equivalent | 07-200-573 | |
| SV40-HCEC immortalized human corneal epithelial cells | N/A | N/A | These cells are not commercially available, but can be obtained from the investigators cited in the article |
| Sceptor Handheld Automated Cell Counter | Millipore or equivalent | PHCC20060 | |
| GeneTitan Multi-Channel (MC) Instrument | Affymetrix or equivalent | 00-0372 | |
| Affymetrix 24- and 96-array plates | Affymetrix or equivalent | 901257; 901434 | |
| Draegger tube HF | Draeger or equivalent | 8103251 | |
| Draegger tube CP | Draeger or equivalent | 8103421 | |
| Draegger pump | Draeger or equivalent | 6400000 | |
| Clear Plate seals | Resesarch Products International or Equivalent | 202502 | |
| Reagent reservoirs | VistaLab Technologies or equivalent | 3054-1000 | |
| Xlfit | IDBS or equivalent | N/A | Excel add-in used for automated curve fitting |
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