Proyección de SiRNA de alto rendimiento para lesión de célula epitelial cloropicrina y córnea inducido por el fluoruro de hidrógeno
Summary
Pequeña proyección inhibitoria de RNA alto rendimiento es una herramienta importante que podría ayudar a aclarar más rápidamente los mecanismos moleculares de la lesión epitelial córnea química. Adjunto, presentamos el desarrollo y validación de modelos de exposición y métodos para el cribado de alto rendimiento de lesiones epiteliales de córnea inducido por el fluoruro de hidrógeno y la cloropicrina.
Abstract
Lesión ocular inducido por la sustancia tóxica es una verdadera emergencia ocular debido a productos químicos tienen el potencial para causar rápidamente daño tisular significativo. Tratamientos para la lesión corneal inducida por tóxicos son generalmente apoyo como no terapéutica específica existen para tratar estas lesiones. En los esfuerzos para el desarrollo de tratamientos y terapias para cuidar de la exposición, puede ser importante comprender los mecanismos moleculares y celulares de estas lesiones. Proponemos que utilización de la detección de RNA (siRNA) inhibitorio pequeño alto rendimiento puede ser una importante herramienta que podría ayudar a aclarar más rápidamente los mecanismos moleculares de la lesión epitelial córnea química. siRNA son doble trenzadas moléculas de ARN que son 19-25 nucleotides largos y utilizan el vía para degradar el mRNA de silenciamiento del gen postranscripcional que tienen homología con el siRNA. La reducción resultante de la expresión del gen específico entonces se puede estudiar en células expuestas sustancias tóxicas para determinar la función de ese gene en la respuesta celular a los tóxicos. El desarrollo y validación de modelos de exposición en vitro y métodos para el alto rendimiento (HTS) de detección de fluoruro de hidrógeno (HF) y cloropicrina-(CP) inducida por lesión ocular se presentan en este artículo. Aunque hemos seleccionado estas dos sustancias tóxicas, nuestros métodos son aplicables al estudio de otras sustancias tóxicas, con pequeñas modificaciones en el protocolo de la exposición de sustancias tóxicas. El antígeno T grande de SV40 inmortalizó HCEC SV40 fue seleccionado para el estudio de línea de células epiteliales corneales humanas. Viabilidad celular y la producción de IL-8 fueron seleccionados como puntos finales en el protocolo de investigación. Varios problemas asociaron con el desarrollo de la exposición de sustancias tóxicas y se presentan métodos de cultivo celular adecuados para estudios HTS. El establecimiento de modelos HTS para estas sustancias tóxicas permite estudios adicionales entender mejor el mecanismo de lesión y pantalla para terapéutica potencial para lesión ocular química.
Introduction
Lesión ocular inducido por la sustancia tóxica es una verdadera emergencia ocular debido a productos químicos tienen el potencial para causar rápidamente daño tisular significativo. Desafortunadamente, tratamientos para la lesión corneal inducida por tóxicos sólo son generalmente apoyo no terapéutica específica existen para tratar estas lesiones. La estrategia actual de tratamiento es inespecífica e incluye principalmente los tratamientos terapéuticos tópicos tales como lubricantes, antibióticos, y ciclopléjicos seguida de antiinflamatorios (por ejemplo, esteroides) una vez la córnea ha re-epithelialized1 ,2. A pesar del mejor tratamiento terapéutico opciones actuales disponibles, pronóstico a largo plazo es generalmente pobre debido a la opacificación corneal progresiva y neovascularización2,3.
Modelos animales se han utilizado tradicionalmente para investigar la toxicidad química y entender los mecanismos de lesión. Sin embargo, los estudios en animales son lentos y caros. También hay esfuerzos para reducir los ensayos con animales. Por ejemplo, la legislación REACH (CE 1907/2006) en la Unión Europea tiene disposiciones destinadas a reducir los ensayos con animales. Las disposiciones incluyen un requisito que las empresas comparten datos con el fin de evitar pruebas animales y obtener la aprobación de la Agencia Europea de sustancias químicas antes de realizar pruebas propuestas en animales. Bajo las disposiciones de REACH, la experimentación con animales deben ser un último recurso. También es el Reglamento Europeo de cosméticos (CE 1223/2009) que eliminando la prueba de cosméticos en animales. Cuando se llevan a cabo estudios en animales, son guiados por los principios de las 3Rs (refinamiento, reducción y sustitución), que proporcionan un marco para la investigación animal más humano, reduciendo el número de animales utilizados y uso de alternativas sin animales siempre que sea posible. Por estas razones, el campo de la toxicología ha intentado adoptar en vitro ensayos que permiten comprender mejor los mecanismos moleculares de toxicidad y pueden hacerse en el más alto rendimiento4. Se trata de un enfoque funcional Toxicología donde sustancias tóxicas se definen por su función y no únicamente por su química. Dado un paso más, funcional toxicogenómica busca entender el rol que juegan de genes específicos en los efectos de sustancias tóxicas5. Con la aplicación de la tecnología de siRNA, pantallas para investigar funciones de los genes en las respuestas moleculares y celulares a sustancias tóxicas pueden realizarse en el alto rendimiento. siRNA son doble trenzado RNA moléculas de 19-25 nucleotides largos que, aprovechando el post transcripcional gen silenciamiento vía presente en todas las células mamíferas6. Sintéticamente estos están fabricados y diseñados para un gen específico de destino. Cuando se introduce en una célula, el siRNA se procesa y se carga una sola hebra, la hebra guía, en el complejo de silenciamiento inducido por RNA (RISC). El siRNA dirige el RISC a una región complementaria de una molécula de mRNA, y el RISC degrada el ARNm. Esto resulta en la reducción de la expresión del gen específico. La reducción resultante de la expresión del gen específico entonces se puede estudiar en células expuestas sustancias tóxicas para determinar la función de ese gene en la respuesta celular a los tóxicos. Este enfoque se ha utilizado para entender más los mecanismos de la susceptibilidad de la ricina y la inducción de AHR-dependiente de CYP1A17,8.
La lista de evaluación de riesgo de terrorismo químico (CTRA) y la lista de productos químicos industriales tóxicos (TIC) ha detallada seleccionadas productos químicos por su toxicidad y potencial para ser lanzado durante un terrorista, guerra o accidente de trabajo evento9. Estamos solicitando un siRNA alto rendimiento proyección enfoque de toxicogenomic (HTS) para el estudio de sustancias tóxicas de Ctra lista, que han sido identificados en riesgo alto de uso en un incidente terrorista. La toxicología tradicional intenta comprender los efectos adversos que tienen sustancias químicas sobre organismos vivos; sin embargo, tenemos un deseo de comprender los mecanismos de la lesión con el fin de informar el desarrollo de terapias y enfoques terapéuticos y posiblemente, para descubrir las moléculas que pueden ser objeto de desarrollo terapéutico. Este esfuerzo de alguna manera puede considerarse análoga a la utilización de proyección de alto rendimiento siRNA y análisis celular basado en el descubrimiento de drogas proceso10. Una diferencia importante es que el descubrimiento de medicamentos normalmente busca un destino singular para descubrimiento terapéutico Considerando que nuestro enfoque es un poco improbable que exista un objetivo singular de alto valor terapéutico para el tratamiento de la exposición de sustancias tóxicas. Esperamos que cualquier paradigma de tratamiento eficaz para la exposición de sustancias tóxicas requeriría un enfoque multifacético para alcanzar alto valor terapéutico, y datos de toxicogenomic vital pueden informar a un paradigma de tratamiento eficaz.
Automatización de mesa aporta metodología de alto rendimiento a laboratorios fuera de la industria farmacéutica o biotecnológica. Los estudios en vitro en nuestro Instituto han sido históricamente los análisis tradicionales que son de bajo rendimiento11,12,13. En los últimos años, nuestro laboratorio ha transición al uso de la robótica de sobremesa para realizar proyección de siRNA de alto rendimiento. Adjunto, presentamos el refinamiento de modelos celulares ocular y el desarrollo de in vitro métodos de exposición para el fluoruro de hidrógeno (HF) y la cloropicrina (CP) adecuado para el cribado de alto rendimiento siRNA. Nuestro objetivo es identificar moléculas que regulan el daño celular en respuesta a estas sustancias tóxicas. Los objetivos de la biblioteca de siRNA que se seleccionaron son receptores acoplados a proteína G, proteína quinasas, proteasas, fosfatasas, canales iónicos y otros objetivos potencialmente druggable. HF y CP fueron seleccionados para estudio por agentes de lista CTRA ToxNet informes de accidentes de trabajo de referencias cruzadas para encontrar a los que presentan el mayor riesgo de lesión ocular por medio de vapor exposición9,14. CP (fórmula química Cl3CNO2, número CAS 76-06-2) fue utilizado originalmente como un gas lacrimógeno en WWI15. Actualmente se utiliza como un fumigante agrícola y funciones como un nematicida, fungicida e insecticida16. Fluoruro de hidrógeno (HF) se utiliza en procesos incluyendo la alquilación en refinerías de petróleo y la fluoración electroquímica de compuestos orgánicos17. HF (fórmula química HF, número CAS 62778-11-4) es un gas pero en su forma acuosa es el ácido fluorhídrico (HFA, CAS número 7664-39-3). Por lo tanto, elegimos utilizar HFA en nuestra celda en modelos de exposición. El antígeno T grande de SV40 inmortalizó HCEC SV40 fue seleccionado para el estudio de línea de células epiteliales corneales humanas. Viabilidad celular y el marcador inflamatorio IL-8 fueron seleccionados como puntos finales porque los objetivos que están implicados en la lesión celular deben reflejarse en la muerte celular y la respuesta inflamatoria. En concreto, si un objetivo debían jugar un papel protector en la exposición de sustancias tóxicas, muerte celular o a la producción de citoquinas inflamatorias debería aumentar cuando se inhibe la expresión de destino por siRNA. Lo contrario sería cierto para blancos que juegan un papel negativo. Asimismo, la inflamación crónica aparece desempeñar un papel en la patología de la córnea después de la exposición y la intervención en las vías de muerte celular pueden mejorar el resultado clínico2,18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Adjunto describimos nuestros métodos y resultados en el desarrollo de una célula epitelial de la córnea de alto rendimiento modelo para el estudio de lesiones en HF y CP de detección. También se presentan los resultados de la pantalla de siRNA primario para lesiones de HF. Hubo muchos desafíos para el desarrollo de modelos HTS para el estudio de las lesiones TIC. Métodos que podríamos encontrar en la literatura relacionada con el estudio de HF, HFA o CP en modelos de cultivo celular fueron de poca ayuda. Mayoría…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue apoyada por el nacional institutos de salud contrarrestar Programa Interinstitucional Convenio # AOD13015-001. Nos gustaría agradecer a Stephanie Froberg y Peter Hurst por sus esfuerzos y conocimientos en producción de vídeo.
Materials
| Bravo liquid handing platform | Agilent or equivalent | G5409A | |
| Bravo plate shaker | Agilent or equivalent | Option 159 | |
| Bravo 96LT disposable tip head | Agilent or equivalent | Option 178 | 96-channel large tip pipetting head unit |
| Bravo 96ST disposable tip head | Agilent or equivalent | Option 177 | 96-channel small tip pipetting head unit |
| Bravo 384ST disposable tip head | Agilent or equivalent | Option 179 | 384-channel small tip pipetting head unit |
| Bravo 96 250 μL sterile barrier tips | Agilent or equivalent | 19477-022 | |
| Bravo 384 30 μL sterile barrier tips | Agilent or equivalent | 19133-212 | |
| Bravo 384 70 μL sterile barrier tips | Agilent or equivalent | 19133-212 | |
| EnSpire multimode plate reader | Perkin Elmer or equivalent | 2300-0000 | AlphaLISA assay detector with high power laser excitation |
| IL-8 (human) AlphaLISA Detection Kit | Perkin Elmer or equivalent | AL224F | no-wash bead-based assay |
| ProxiPlate-384 Plus white 384-shallow well microplates | Perkin Elmer or equivalent | 6008359 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen or equivalent | 13778500 | Transfection reagent |
| Opti-MEM 1 Reduced Serum Medium | Invitrogen or equivalent | 31985070 | |
| TrypLE Express | Gibco or equivalent | 12605010 | Cell detachment solution |
| IncuCyte Zoom | Essen Instruments or equivalent | ESSEN BIOSCI 4473 | Incubator-housed automated microscope |
| Chloropicrin | Trinity Manufacturing or equivalent | N/A | Acute toxicity and irritant |
| DMEM-F12 cell culture medium | Invitrogen or equivalent | 11330-057 | Contains HEPES |
| Fetal bovine serum | Invitrogen or equivalent | 1891471 | |
| Human epidermal growth factor (cell culture grade) | Invitrogen or equivalent | E9644-.2MG | |
| Recombinant human insulin (cell culture grade) | Invitrogen or equivalent | 12585-014 | |
| Penicillin-Streptomycin solution (cell culture grade) | Invitrogen or equivalent | 15140122 | |
| Hydrocortisone (cell culture grade) | Sigma or equivalent | H0888-10G | |
| Glucose (cell culture grade) | Sigma or equivalent | G7021 | |
| PBS (cell culture grade) | Sigma or equivalent | P5493 | |
| siRNA | Dharmacon or equivalent | various | |
| Thiazolyl blue tetrazolium bromide | Sigma or equivalent | M5655 | MTT assay substrate |
| siRNA buffer | Thermo or equivalent | B002000 | |
| 96-well cell culture plates | Corning or equivalent | CLS3595 | |
| T150 cell culture flasks | Corning or equivalent | CLS430825 | |
| BSL-2 cell culture hood | Nuaire or equivalent | NU-540 | |
| 300 mL robotic reservoirs | Thermo or equivalent | 12-565-572 | |
| 96 baffled automation reservoirs | Thermo or equivalent | 1064-15-8 | |
| 500 mL sterile disposable storage bottles | Corning or equivalent | CLS430282 | |
| Microplate heat sealer | Thermo or equivalent | AB-1443A | |
| Microplate heat sealing foil | Thermo or equivalent | AB-0475 | |
| Cardamonin | Tocris or equivalent | 2509 | Anti-inflammatory, used as positive control |
| SKF 86002 | Tocris or equivalent | 2008 | Anti-inflammatory, used as positive control |
| DMSO | Sigma or equivalent | D8418 | |
| 48% hydrofluoric acid | Sigma or equivalent | 339261 | Corrosive and acute toxicity |
| 1000 μL Single channel pipettors | Rainin or equivalent | 17014382 | |
| 200 μL Single channel pipettors | Rainin or equivalent | 17014391 | |
| 20 μL Single channel pipettors | Rainin or equivalent | 17014392 | |
| 1000 μL 12-channel pipettors | Rainin or equivalent | 17014497 | |
| 200 μL 12-channel pipettors | Rainin or equivalent | 17013810 | |
| 20 μL 12-channel pipettors | Rainin or equivalent | 17013808 | |
| Pipettor tips 1000 μL | Rainin or equivalent | 17002920 | |
| Pipettor tips 200 μL | Rainin or equivalent | 17014294 | |
| Pipettor tips 20 μL | Rainin or equivalent | 17002928 | |
| Chemical fume hood | Jamestown Metal Products | MHCO_229 | |
| 384-well sample storage plates | Thermo or equivalent | 262261 | |
| Sodium chloride | Sigma or equivalent | S6191 | |
| 50 mL conical tubes | Thermo or equivalent | 14-959-49A | |
| Serological pipettes 50 mL | Corning or equivalent | 07-200-576 | |
| Serological pipettes 25 mL | Corning or equivalent | 07-200-575 | |
| Serological pipettes 10 mL | Corning or equivalent | 07-200-574 | |
| Serological pipettes 5 mL | Corning or equivalent | 07-200-573 | |
| SV40-HCEC immortalized human corneal epithelial cells | N/A | N/A | These cells are not commercially available, but can be obtained from the investigators cited in the article |
| Sceptor Handheld Automated Cell Counter | Millipore or equivalent | PHCC20060 | |
| GeneTitan Multi-Channel (MC) Instrument | Affymetrix or equivalent | 00-0372 | |
| Affymetrix 24- and 96-array plates | Affymetrix or equivalent | 901257; 901434 | |
| Draegger tube HF | Draeger or equivalent | 8103251 | |
| Draegger tube CP | Draeger or equivalent | 8103421 | |
| Draegger pump | Draeger or equivalent | 6400000 | |
| Clear Plate seals | Resesarch Products International or Equivalent | 202502 | |
| Reagent reservoirs | VistaLab Technologies or equivalent | 3054-1000 | |
| Xlfit | IDBS or equivalent | N/A | Excel add-in used for automated curve fitting |
References
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