Summary

High Throughput Screening SiRNA per lesione delle cellule epiteliali cloropicrina e Cornea indotta da acido fluoridrico

Published: June 16, 2018
doi:

Summary

Screening RNA inibitorio piccolo su vasta scala è uno strumento importante che potrebbe contribuire a delucidare più rapidamente i meccanismi molecolari di lesioni epiteliali cornea chimica. Qui, presentiamo lo sviluppo e la convalida dei modelli di esposizione e dei metodi per lo screening di elevato throughput di indotta da acido fluoridrico e cloropicrina lesioni epiteliali cornea.

Abstract

Lesione oculare indotta da tossico è una vera emergenza oculare perché prodotti chimici hanno il potenziale per rapidamente infliggere danni ai tessuti significativi. Trattamenti per lesione corneale indotta da tossico sono generalmente solidale come nessun terapeutica specifica esiste per il trattamento di queste lesioni. Negli sforzi per sviluppare trattamenti e terapie di cura per l’esposizione, può essere importante capire i meccanismi cellulari e molecolari di queste lesioni. Proponiamo che l’utilizzo di screening inibitorio piccoli RNA (siRNA) su vasta scala può essere uno strumento importante che potrebbe contribuire a delucidare più rapidamente i meccanismi molecolari di lesioni epiteliali cornea chimica. siRNA sono doppio incagliati molecole RNA che sono 19-25 nucleotidi lunghi e utilizzano il percorso per degradare mRNA il silenziamento genico post-trascrizionale che hanno omologia al siRNA. La conseguente riduzione dell’espressione del gene specifico può essere studiata quindi nelle cellule esposte tossico per accertare la funzione di quel gene nella risposta cellulare alla sostanza tossica. Lo sviluppo e la validazione di modelli di esposizione in vitro e metodiche per l’alto throughput screening (HTS) di fluoruro di idrogeno (HF) e cloropicrina-(CP) indotto ferita oculare sono presentati in questo articolo. Sebbene abbiamo scelto queste due sostanze tossiche, i nostri metodi sono applicabili allo studio di altre sostanze tossiche con lievi modifiche al protocollo esposizione tossico. Il grande T antigene SV40 immortalato linea di cellule epiteliali corneali umane CHE SV40-HCEC è stato selezionato per lo studio. La vitalità cellulare e la produzione di IL-8 sono stati selezionati come endpoint nel protocollo di screening. Diverse sfide associate con lo sviluppo dell’esposizione tossico e metodi di coltura cellulare adatti per studi HTS sono presentati. La creazione di modelli HTS per queste sostanze tossiche consente ulteriori studi per capire meglio il meccanismo della ferita e alla schermata per potenziali terapie per ferita oculare chimica.

Introduction

Lesione oculare indotta da tossico è una vera emergenza oculare perché prodotti chimici hanno il potenziale per rapidamente infliggere danni ai tessuti significativi. Purtroppo, trattamenti per lesione corneale indotta da tossico sono generalmente solidale solo come terapie specifiche non esistono per trattare queste lesioni. L’attuale strategia di trattamento è aspecifica e comprende principalmente trattamenti topici terapeutici come lubrificanti, antibiotici, e cycloplegics seguita da antinfiammatori (ad es., steroidi) una volta la cornea ha re-epithelialized1 ,2. Nonostante il migliore trattamento terapeutico opzioni correnti disponibili, prognosi a lungo termine è generalmente scarsa a causa di appannamento corneale progressiva e neovascolarizzazione2,3.

Modelli animali sono stati utilizzati tradizionalmente per tossicità chimica di studiare e comprendere i meccanismi della ferita. Tuttavia, gli studi sugli animali sono lunghe e costose. Ci sono anche gli sforzi per ridurre la sperimentazione animale. Ad esempio, la normativa REACH (CE 1907/2006) dell’Unione europea ha disposizioni destinate a ridurre la sperimentazione. Le disposizioni sono un requisito che aziende condividono dati al fine di evitare la sperimentazione animale e ottenere l’approvazione dall’Agenzia chimica europea prima di eseguire i test proposti sugli animali. Ai sensi delle disposizioni del regolamento REACH, sperimentazione animale dovrebbe essere l’ultima risorsa. C’è anche il regolamento Cosmetici europeo (CE 1223/2009) che gradualmente la sperimentazione dei cosmetici negli animali. Quando vengono effettuati studi sull’animale, sono guidati dai principi di 3R (raffinatezza, riduzione e sostituzione), che forniscono un quadro per eseguire ricerca animale più umana, riducendo il numero di animali utilizzati e l’utilizzo delle alternative non animali ove possibile. Per questi motivi, il campo della tossicologia ha cercato di adottare saggi in vitro che possono fornire la comprensione nei meccanismi molecolari di tossicità e possono essere fatto in maggiore velocità di trasmissione4. Si tratta di un approccio funzionale tossicologia cui sostanze tossiche sono definite dalla loro funzione, piuttosto che esclusivamente da loro chimica. Compiuto un passo in avanti, funzionale toxicogenomics cercano di capire il ruolo che specifici geni svolgono negli effetti di sostanze tossiche5. Con l’applicazione della tecnologia siRNA, schermi per studiare la funzione del gene nelle risposte molecolari e cellulari alle sostanze tossiche possono essere fatto in alto throughput. siRNA sono molecole di RNA incagliati doppi che sono 19-25 nucleotidi lunghi che sfruttano la presente in tutte le cellule di mammiferi6via post silenziamento trascrizionale del gene. Questi sono sinteticamente fatto e progettati per indirizzare un gene specifico. Quando introdotti in una cella, viene elaborato il siRNA e un filo, il filo guida, viene caricato il complesso di silenziamento indotto da RNA (RISC). Gli siRNA dirige il RISC ad una regione complementare in una molecola di mRNA, e il RISC degrada il mRNA. Questo comporta la riduzione dell’espressione del gene specifico. La conseguente riduzione dell’espressione del gene specifico può essere studiata quindi nelle cellule esposte tossico per accertare la funzione di quel gene nella risposta cellulare alla sostanza tossica. Tale approccio è stato utilizzato per capire meglio i meccanismi di suscettibilità di ricina e l’induzione di AHR-dipendente di CYP1A17,8.

L’elenco di valutazione di rischio del terrorismo chimico (CTRA) e gli elenchi di prodotti chimici industriali tossici (TIC) sono riportati in dettaglio selezionare prodotti chimici basati sulla loro tossicità e il potenziale per essere rilasciato nel corso di un terrorista, guerra o incidente industriale evento9. Stiamo applicando un throughput elevato di siRNA (HTS) toxicogenomic metodo per lo studio delle sostanze tossiche di elenco CTRA, che sono stati identificati per essere ad alto rischio di uso in un atto terroristico della selezione. Tossicologia tradizionale cerca di comprendere gli effetti avversi che hanno sostanze chimiche sugli organismi viventi; Tuttavia, abbiamo un ulteriore desiderio di comprendere i meccanismi della ferita allo scopo di informare lo sviluppo di terapeutica e approcci terapeutici e possibilmente, per scoprire le molecole che possono essere mirate per lo sviluppo terapeutico. Questo sforzo in un certo senso può essere considerato analogo all’uso di screening su vasta scala siRNA e saggi di cellulare basato nella droga scoperta processo10. Una differenza principale sarebbe che l’individuazione della droga tipicamente cerca una destinazione singolare per la scoperta terapeutica, considerando che il nostro approccio è alquanto improbabile che ci sarebbe una destinazione singolare con alto valore terapeutico per il trattamento dell’esposizione tossico. Prevediamo che qualsiasi paradigma di trattamento efficace per l’esposizione tossico richiederebbe un approccio multi-angolare per raggiungere alto valore terapeutico, e toxicogenomic dati vitale possono informare un paradigma di trattamento efficace.

Automazione del laboratorio porta metodologia throughput elevato ai laboratori fuori le industrie farmaceutiche o biotecnologiche. Gli studi in vitro al nostro Istituto sono state storicamente le analisi tradizionali che sono di bassa velocità effettiva11,12,13. Negli ultimi anni, il nostro laboratorio ha eseguito la transizione per l’utilizzo della robotica da banco per eseguire screening su vasta scala siRNA. Qui, presentiamo la raffinatezza dei modelli cellulari oculare e lo sviluppo in vitro di metodi di esposizione per acido fluoridrico (HF) e cloropicrina (CP) adatto per screening su vasta scala siRNA. Il nostro obiettivo è quello di identificare molecole che regolano la lesione cellulare in risposta a queste sostanze tossiche. Gli obiettivi della biblioteca siRNA che abbiamo selezionato sono recettori accoppiati a proteine G, proteinchinasi, proteasi, fosfatasi, canali ionici e altri potenzialmente bersagli. HF e CP sono stati selezionati per lo studio incrociando CTRA elenco agenti con i rapporti ToxNet degli incidenti industriali per trovare quelli che presentano il maggior rischio di lesioni oculari tramite vapore esposizione9,14. CP (formula chimica Cl3CNO2, numero CAS 76-06-2) è stato originariamente utilizzato come un gas lacrimogeni in WWI15. Attualmente è stato utilizzato come un fumigante agricolo e funzioni come un insetticida, fungicida e nematocida16. Acido fluoridrico (HF) è utilizzato nei processi tra cui di alchilazione in raffinerie di petrolio e fluorurazione elettrochimica di composti organici17. HF (formula chimica HF, numero CAS 62778-11-4) è un gas, ma nella sua forma acquosa è l’acido fluoridrico (HFA, CAS 7664-39-3 di numero). Pertanto, abbiamo scelto di utilizzare HFA nella nostra cella in modelli di esposizione. Il grande T antigene SV40 immortalato linea di cellule epiteliali corneali umane CHE SV40-HCEC è stato selezionato per lo studio. La vitalità cellulare e il marcatore infiammatorio IL-8 sono stati selezionati come endpoint perché gli obiettivi che sono coinvolti nella lesione cellulare dovrebbero riflettersi nella morte delle cellule e la risposta infiammatoria. In particolare, se una destinazione dovesse svolgere un ruolo protettivo nell’esposizione tossico, morte delle cellule e/o la produzione di citochine infiammatorie dovrebbe aumentare quando l’espressione di destinazione è inibita da siRNA. Il contrario sarebbe vero per gli obiettivi che giocano un ruolo negativo. Inoltre, l’infiammazione cronica sembra svolgere un ruolo nella patologia della cornea dopo l’esposizione e l’intervento nelle vie di morte delle cellule può migliorare il risultato clinico2,18.

Protocol

1. cella cultura manutenzione Crescere la linea cellulare SV40-HCEC a 37 ° C, 5% CO2e 90% di umidità in DMEM F-12 con 15% siero bovino fetale (FBS), 1% L-Glutammina, 10 µ g/L fattore di crescita (EGF) e di 5 mg/L insulina. Passaggio della linea cellulare ogni 3-4 giorni (a seconda della densità di semina) per garantire che confluency mai supera l’80% durante la manutenzione di cultura. Staccare le cellule da boccette utilizzando una soluzione di distacco (14 mL di soluzione pe…

Representative Results

Sviluppo del metodo di esposizione Abbiamo raffinato ed abbiamo valutato l’idoneità della linea cellulare epiteliale corneale umana SV40-HCEC per uso negli studi HTS. SV40-HCEC furono immortalati utilizzando il grande T antigene di SV-40 e sono stati un regalo da Dhanajay Pal23. C’erano troppe variabili Esplorate nello sviluppo di metodologia di esposizione per presentare brevemente nel …

Discussion

Qui descriviamo i nostri metodi e risultati sullo sviluppo di una cellula epiteliale di cornea elevato throughput screening modello per lo studio delle lesioni HF e CP. Inoltre presentiamo i risultati dalla schermata principale siRNA per lesioni HF. C’erano molte sfide per lo sviluppo di modelli HTS per lo studio delle lesioni TIC. Metodi che potremmo trovare nella letteratura relazionata allo studio di HF, HFA o CP in modelli di coltura cellulare erano di poco aiuto. Maggior parte dei studi in vitro sullo ione …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questa ricerca è stata sostenuta dalla nazionale istituti di salute contrastare programma Interagency accordo # AOD13015-001. Vorremmo ringraziare Stephanie Froberg e Peter Hurst per l’impegno e la competenza sulla produzione video.

Materials

Bravo liquid handing platform Agilent or equivalent G5409A
Bravo plate shaker Agilent or equivalent Option 159
Bravo 96LT disposable tip head Agilent or equivalent Option 178 96-channel large tip pipetting head unit
Bravo 96ST disposable tip head Agilent or equivalent Option 177 96-channel small tip pipetting head unit
Bravo 384ST disposable tip head Agilent or equivalent Option 179 384-channel small tip pipetting head unit
Bravo 96 250 μL sterile barrier tips Agilent or equivalent 19477-022
Bravo 384 30 μL sterile barrier tips Agilent or equivalent 19133-212
Bravo 384 70 μL sterile barrier tips Agilent or equivalent 19133-212
EnSpire multimode plate reader Perkin Elmer or equivalent 2300-0000 AlphaLISA assay detector with high power laser excitation
IL-8 (human) AlphaLISA Detection Kit  Perkin Elmer or equivalent AL224F no-wash bead-based assay
ProxiPlate-384 Plus white 384-shallow well microplates Perkin Elmer or equivalent 6008359
Lipofectamine RNAiMAX Invitrogen or equivalent 13778500 Transfection reagent
Opti-MEM 1 Reduced Serum Medium Invitrogen or equivalent 31985070
TrypLE Express Gibco or equivalent 12605010 Cell detachment solution
IncuCyte Zoom Essen Instruments or equivalent ESSEN BIOSCI 4473 Incubator-housed automated microscope
Chloropicrin Trinity Manufacturing or equivalent N/A Acute toxicity and irritant
DMEM-F12 cell culture medium Invitrogen or equivalent 11330-057 Contains HEPES
Fetal bovine serum Invitrogen or equivalent 1891471
Human epidermal growth factor (cell culture grade) Invitrogen or equivalent E9644-.2MG
Recombinant human insulin (cell culture grade) Invitrogen or equivalent 12585-014
Penicillin-Streptomycin solution (cell culture grade) Invitrogen or equivalent 15140122
Hydrocortisone (cell culture grade) Sigma or equivalent H0888-10G
Glucose  (cell culture grade) Sigma or equivalent G7021
PBS  (cell culture grade) Sigma or equivalent P5493
siRNA Dharmacon or equivalent various
Thiazolyl blue tetrazolium bromide Sigma or equivalent M5655 MTT assay substrate
siRNA buffer Thermo or equivalent B002000
96-well cell culture plates Corning or equivalent CLS3595
T150 cell culture flasks Corning or equivalent CLS430825
BSL-2 cell culture hood Nuaire or equivalent NU-540
300 mL robotic reservoirs Thermo or equivalent 12-565-572 
96 baffled automation reservoirs Thermo or equivalent 1064-15-8
500 mL sterile disposable storage bottles Corning or equivalent CLS430282
Microplate heat sealer Thermo or equivalent AB-1443A
Microplate heat sealing foil Thermo or equivalent AB-0475
Cardamonin Tocris or equivalent 2509 Anti-inflammatory, used as positive control
SKF 86002  Tocris or equivalent 2008 Anti-inflammatory, used as positive control
DMSO Sigma or equivalent D8418
48% hydrofluoric acid Sigma or equivalent 339261 Corrosive and acute toxicity
1000 μL Single channel pipettors Rainin or equivalent 17014382
200 μL Single channel pipettors Rainin or equivalent 17014391
20 μL Single channel pipettors Rainin or equivalent 17014392
1000 μL 12-channel pipettors Rainin or equivalent 17014497
200 μL 12-channel pipettors Rainin or equivalent 17013810
20 μL 12-channel pipettors Rainin or equivalent 17013808
Pipettor tips 1000 μL Rainin or equivalent 17002920
Pipettor tips 200 μL Rainin or equivalent 17014294
Pipettor tips 20 μL Rainin or equivalent 17002928
Chemical fume hood Jamestown Metal Products MHCO_229
384-well sample storage plates Thermo or equivalent 262261
Sodium chloride Sigma or equivalent S6191
50 mL conical tubes Thermo or equivalent 14-959-49A
Serological pipettes 50 mL Corning or equivalent 07-200-576
Serological pipettes 25 mL Corning or equivalent 07-200-575
Serological pipettes 10 mL Corning or equivalent 07-200-574
Serological pipettes 5 mL Corning or equivalent 07-200-573
SV40-HCEC immortalized human corneal epithelial cells N/A N/A These cells are not commercially available, but can be obtained from the investigators cited in the article
Sceptor Handheld Automated Cell Counter Millipore or equivalent PHCC20060
GeneTitan Multi-Channel (MC) Instrument Affymetrix or equivalent 00-0372
Affymetrix 24- and 96-array plates Affymetrix or equivalent 901257; 901434
Draegger tube HF Draeger or equivalent 8103251
Draegger tube CP Draeger or equivalent 8103421
Draegger pump Draeger or equivalent 6400000
Clear Plate seals Resesarch Products International or Equivalent 202502
Reagent reservoirs VistaLab Technologies or equivalent 3054-1000
Xlfit IDBS or equivalent N/A Excel add-in used for automated curve fitting

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Cite This Article
Lehman, J. G., Causey, R. D., LaGrasta, C. V., Ruff, A. L. High Throughput SiRNA Screening for Chloropicrin and Hydrogen Fluoride-Induced Cornea Epithelial Cell Injury. J. Vis. Exp. (136), e57372, doi:10.3791/57372 (2018).

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