תפוקה גבוהה SiRNA ואיתור Chloropicrin ופציעות תאים אפיתל הקרנית מימן פלואוריד-Induced

Summary

תפוקה גבוהה קטן מעכבות RNA ההקרנה היא כלי חשוב זה יכול לעזור להבהיר את המנגנונים המולקולריים של פגיעה אפיתל הקרנית כימיים במהירות רבה יותר. במסמך זה, אנו מציגים את הפיתוח ואת האימות של חשיפה מודלים ושיטות להקרנה תפוקה גבוהה של מימן פלואוריד – ו chloropicrin-induced פציעה אפיתל הקרנית.

Abstract

Toxicant-induced חבלה עינית היא מקרה חירום אמיתי עינית כימיקלים יש פוטנציאל לגרום נזק לרקמות משמעותי במהירות. טיפולים toxicant-induced פציעה קרניות הן בדרך כלל תומכת הרפוי ספציפי לא קיים כדי לטפל בפציעות אלה. ב המאמצים לפתח טיפולים ותרופות לטיפול בחשיפה, זה יכול להיות חשוב כדי להבין את המנגנונים הסלולר המולקולריים של הפציעות. אנו מציעים כי ניצול תפוקה גבוהה קטן מעכבות ההקרנה RNA (siRNA) יכול להיות כלי חשוב זה יכול לעזור להבהיר את המנגנונים המולקולריים של פגיעה אפיתל הקרנית כימיים במהירות רבה יותר. siRNA הם כפול נטושים מולקולות RNA 19-25 נוקלאוטידים ארוך, לנצל את הגן post-transcriptional להשתיק מסלול ארוך mRNA אשר יש הומולוגיה ל siRNA. ואז ניתן יהיה ללמוד וכתוצאה מכך הפחתת ביטוי גנים ספציפיים בתאים חשוף toxicant כדי לברר את הפונקציה של הגן הזה התגובה התאית toxicant. פיתוח, אימות של במבחנה חשיפה מודלים ושיטות תפוקה גבוהה הקרנת (HTS) של מימן פלואוריד-(HF) ו- chloropicrin-(CP) המושרה חבלה עינית מוצגים במאמר זה. למרות בחרנו אלה שני חשיפה לרעלים, השיטות שלנו חלים במחקר של חשיפה לרעלים אחרים עם שינויים מזעריים פרוטוקול החשיפה toxicant. SV40 גדול T אנטיגן מונצחים תאי אפיתל הקרנית אדם קו ש-SV40-HCEC נבחר למחקר. תא הכדאיות וייצור IL-8 נבחרו נקודות קצה בפרוטוקול ההקרנה. מספר אתגרים הקשורים עם הפיתוח של חשיפה toxicant, שיטות התרבות תאים מתאימים ללימודי HTS מוצגים. הקמת HTS מודלים עבור חשיפה לרעלים אלו מאפשר מחקרים נוספים להבין טוב יותר את מנגנון הפגיעה, למסך הרפוי פוטנציאל כימי חבלה עינית.

Introduction

Toxicant-induced חבלה עינית היא מקרה חירום אמיתי עינית כימיקלים יש פוטנציאל לגרום נזק לרקמות משמעותי במהירות. למרבה הצער, טיפולים toxicant-induced פציעה הקרנית רק תומכות באופן כללי כפי הרפוי ספציפי לא קיים כדי לטפל בפציעות אלה. אסטרטגיית הטיפול הנוכחי הוא לא ספציפית וכולל בעיקר אקטואלי טיפולים רפואיים כגון חומרי סיכה, אנטיביוטיקה, ואחריו cycloplegics דלקתיות (למשל, סטרואידים) פעם הקרנית יש מחדש epithelialized^{1 ,2}. למרות האפשרויות הטובות ביותר הנוכחי טיפולית זמינה, הפרוגנוזה לטווח ארוך היא ירודה עקב ערפול הקרנית מתקדמת ו-^2,כורוידאלית³.

מודלים בעלי חיים באופן מסורתי שימש לחקור רעילה ולהבין מנגנונים של פציעה. עם זאת, מחקרים שנעשו בבעלי חיים הם זמן רב ויקר. ישנם גם המאמצים לצמצום הניסויים בחיות. לדוגמה, להגיע חקיקה (EC 1907/2006) באיחוד האירופי כולל מגוון הוראות שנועדו להפחית את הניסויים בחיות. התנאים כוללים דרישה לחברות לשתף את הנתונים כדי למנוע חיות בדיקות וקבלת אישור מהסוכנות הכימיקלים האירופי לפני ביצוע בדיקות המוצע על בעלי חיים. לפי קביעותיה של יד, ניסויים בבעלי חיים צריך להיות המוצא האחרון. יש גם אירופה קוסמטיקה תקנה (EC 1223/2009) בהדרגה בדיקה של קוסמטיקה בבעלי חיים. כאשר נערכים מחקרים שנעשו בבעלי חיים, הם מונחים על ידי העקרונות של 3Rs (עידון, צמצום, והחלפת), המספקות מסגרת עבור ביצוע מחקר בבעלי חיים אנושית יותר, להפחית את מספר בעלי החיים שבהם משתמשים ושימוש חלופות לניסויים בבעלי חיים במידת האפשר. מסיבות אלו, בתחום של הרעלים יש ביקשו לאמץ מבחני במבחנה יכולה לספק תובנות המנגנונים המולקולריים של רעילות, יכולה להיעשות תפוקה גבוהה⁴. זה גישה פונקציונלית הרעלים שבו חשיפה לרעלים מוגדרים על-ידי הפונקציה שלהם במקום אך ורק הכימיה שלהם. לקחו צעד נוסף, פונקציונלי toxicogenomics מבקשים להבין את תפקידים גנים ספציפיים לשחק את ההשפעות של חשיפה לרעלים⁵. עם היישום של טכנולוגיה siRNA, מסכי לחקור את פונקציית ג’ין מולקולרית, תאית התגובות חשיפה לרעלים יכול להיעשות על תפוקה גבוהה. siRNA הם כפול מולקולות RNA נטושים המהווים 19-25 נוקלאוטידים ארוך זה את היתרון של ג’ין תעתיק פוסט נוכח תאים בתרבית של כל⁶שתיקה מסלול. אלה הם לאכסון גרם, שנועדו למטרה גנים ספציפיים. כאשר הציג לתוך תא, siRNA מעובד, גדיל אחד, סטרנד מדריך, הוא נטען לתוך המתחם שתיקה RNA-induced (RISC). SiRNA מנחה את RISC לאזור משלימים ב מולקולת mRNA, RISC מבזה את ה-mRNA. התוצאה היא הפחתת ביטוי גנים ספציפיים. ואז ניתן יהיה ללמוד וכתוצאה מכך הפחתת ביטוי גנים ספציפיים בתאים חשוף toxicant כדי לברר את הפונקציה של הגן הזה התגובה התאית toxicant. גישה כזו שימש להבין עוד יותר את המנגנונים של רגישות ריצין ומעגל תלויי-אמפר לשעה של^7,CYP1A1⁸.

הרשימה הערכת הסיכון טרור כימי (CTRA), את הרישומים כימיקלים תעשייתיים רעילים (טיק) יש מפורטות כימיקלים בחירה המבוססת על שלהם רעילות ופוטנציאל להשתחרר במהלך טרור, לוחמה או אירוע תאונה תעשייתית⁹. אנחנו הם מיישמים תפוקה גבוהה של siRNA ההקרנה (HTS) toxicogenomic גישת המחקר של CTRA רשימה חשיפה לרעלים, אשר זוהו להיות בסיכון גבוה של שימוש באירוע טרור. טוקסיקולוגיה מסורתי החותר להבין את ההשפעות השליליות שיש כימיקלים על היצורים החיים; עם זאת, יש לנו שאיפה נוספת להבין את המנגנונים של פגיעה לצורך הסברה הפיתוח של הרפוי, גישות טיפוליות, וייתכן, כדי לגלות את מולקולות אשר ניתן לפלח לפיתוח טיפולית. את המאמץ הזה במובנים מסוימים עשויים להיחשב מקביל לשימוש של ההקרנה siRNA תפוקה גבוהה והתא המבוסס על מבחני תהליך הגילוי סמים¹⁰. ההבדל גדול יהיה שגילוי סמים בדרך כלל מחפש מטרה יחידה טיפולית גילוי ואילו בגישה שלנו זה במידת מה לא סביר שיהיה שם יעד יחיד עם ערך טיפולי רב לטיפול של חשיפה toxicant. אנו צופים כי כל פרדיגמה טיפול יעיל לחשיפה toxicant ידרוש גישה רב-תחומית כדי להשיג ערך טיפולי רב, toxicogenomic נתונים חיוני יכול לעדכן את הפרדיגמה של טיפול יעיל.

Benchtop אוטומציה מביא תפוקה גבוהה מתודולוגיה מעבדות בחוץ תעשיות פרמצבטיות או ביוטכנולוגיה. מחקרים במבחנה במכון שלנו היו מבחני מסורתי אשר תפוקה נמוכה^11,12,13. בשנים האחרונות, המעבדה שלנו עברה לקביעת השימוש benchtop רובוטיקה לבצע סינון siRNA תפוקה גבוהה. במסמך זה, אנו מציגים את העידון של התא עינית מודלים ופיתוח של במבחנה שיטות חשיפה מימן פלואוריד (HF) ו chloropicrin (CP) מתאימה להקרנה siRNA תפוקה גבוהה. המטרה שלנו היא לזהות מולקולות המסדירים הסלולר פגיעה בתגובה חשיפה לרעלים אלו. המטרות של הספרייה siRNA בחרנו כוללים G-חלבון בשילוב קולטנים חלבונים kinases, פרוטאזות, phosphatases, תעלות יונים, מטרות נוספות שעשויות להיות druggable. HF ו- CP נבחרו למחקר נצליב CTRA רשימת סוכנים עם הדיווחים ToxNet של תאונות תעשייתיות כדי למצוא את אלה שמציגים הסיכון הגדול ביותר לפגיעה עינית באמצעות אדים חשיפה^9,14. CP (כתיב כימי Cl₃מפקדת₂, מספר CAS 76-06-2) שימש במקור גז מדמיע ב מלחמת העולם הראשונה¹⁵. הוא משמש כיום וגם fumigant החקלאי של פונקציות כמו nematicide ‘, ‘ פטריות, חרקים¹⁶. מימן פלואוריד (HF) משמש בתהליכי כולל אלקילציה בתי זיקוק לנפט, fluorination אלקטרוכימי של תרכובות אורגניות¹⁷. HF (נוסחת הכימי HF, מספר CAS 62778-11-4) הוא גז אבל בצורתו מימית הוא חומצה הידרופלואורית (HFA, CAS מספר 7664-39-3). לכן, אנחנו נבחר להשתמש HFA בתא שלנו בתוך מודלים חשיפה. SV40 גדול T אנטיגן מונצחים תאי אפיתל הקרנית אדם קו ש-SV40-HCEC נבחר למחקר. תא הכדאיות ו- the marker דלקתיות IL-8 נבחרו כמו נקודות הקצה כי מטרות המעורבים פציעה הסלולר אמורה להשתקף בשעת המוות התא ואת התגובה דלקתיות. באופן ספציפי, אם המטרה לשחק תפקיד מגן חשיפה toxicant, מוות של תאים ו/או ייצור ציטוקינים דלקתיים צריך להגדיל כאשר הביטוי היעד מעוכבת על ידי siRNA. ההפך יהיה נכון לגבי מטרות כי תפקיד שלילי. בנוסף, דלקת כרונית מופיע לשחק תפקיד בפתולוגיה הקרנית לאחר חשיפה, התערבות במשעולים מוות התא עשוי לשפר את התוצאה הקלינית^2,18.

Protocol

1. תא תרבות תחזוקה לגדל את שורת התאים SV40-HCEC-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2ו- 90% לחות DMEM F-12 עם 15% סרום שור עוברית (FBS), 1%-גלוטמין, 10 µg/L גורם הגדילה באפידרמיס (EGF) ו- 5 מ”ג/ליטר אינסולין. מעבר לקו תא כל 3-4 ימים (תלוי צפיפות זריעה) כדי להבטיח כי confluency אף פעם לא עולה 80% בזמן תחזוקה תרבות. ניתוק תא…

Representative Results

פיתוח שיטות חשיפה אנו מעודן, הערכת ההתאמה של הקו תאי אפיתל הקרנית אדם SV40-HCEC לשימוש במחקרים השודדים. SV40-HCEC היו מונצחים באמצעות SV-40 גדול T אנטיגן, היו מתנה חבר Dhanajay23. היו יותר מדי משתנים בציורו חשיפה פיתוח מתודולוגיה להצ…

Discussion

במסמך זה אנו מתארים תוצאות ושיטות שלנו על הפיתוח של תפוקה גבוהה קרנית תא אפיתל הקרנת מודל המחקר של פציעות HF ו- CP. אנו מציגים גם את התוצאות מהמסך הראשי siRNA HF להיפצע. היו אתגרים רבים לפיתוח מודלים HTS לצורך המחקר של פציעות טיק. שיטות שיכולנו למצוא בספרות הקשורים בחקר HF, HFA או CP במודלים התרבות התא ?…

Materials

Bravo liquid handing platform	Agilent or equivalent	G5409A
Bravo plate shaker	Agilent or equivalent	Option 159
Bravo 96LT disposable tip head	Agilent or equivalent	Option 178	96-channel large tip pipetting head unit
Bravo 96ST disposable tip head	Agilent or equivalent	Option 177	96-channel small tip pipetting head unit
Bravo 384ST disposable tip head	Agilent or equivalent	Option 179	384-channel small tip pipetting head unit
Bravo 96 250 μL sterile barrier tips	Agilent or equivalent	19477-022
Bravo 384 30 μL sterile barrier tips	Agilent or equivalent	19133-212
Bravo 384 70 μL sterile barrier tips	Agilent or equivalent	19133-212
EnSpire multimode plate reader	Perkin Elmer or equivalent	2300-0000	AlphaLISA assay detector with high power laser excitation
IL-8 (human) AlphaLISA Detection Kit	Perkin Elmer or equivalent	AL224F	no-wash bead-based assay
ProxiPlate-384 Plus white 384-shallow well microplates	Perkin Elmer or equivalent	6008359
Lipofectamine RNAiMAX	Invitrogen or equivalent	13778500	Transfection reagent
Opti-MEM 1 Reduced Serum Medium	Invitrogen or equivalent	31985070
TrypLE Express	Gibco or equivalent	12605010	Cell detachment solution
IncuCyte Zoom	Essen Instruments or equivalent	ESSEN BIOSCI 4473	Incubator-housed automated microscope
Chloropicrin	Trinity Manufacturing or equivalent	N/A	Acute toxicity and irritant
DMEM-F12 cell culture medium	Invitrogen or equivalent	11330-057	Contains HEPES
Fetal bovine serum	Invitrogen or equivalent	1891471
Human epidermal growth factor (cell culture grade)	Invitrogen or equivalent	E9644-.2MG
Recombinant human insulin (cell culture grade)	Invitrogen or equivalent	12585-014
Penicillin-Streptomycin solution (cell culture grade)	Invitrogen or equivalent	15140122
Hydrocortisone (cell culture grade)	Sigma or equivalent	H0888-10G
Glucose  (cell culture grade)	Sigma or equivalent	G7021
PBS  (cell culture grade)	Sigma or equivalent	P5493
siRNA	Dharmacon or equivalent	various
Thiazolyl blue tetrazolium bromide	Sigma or equivalent	M5655	MTT assay substrate
siRNA buffer	Thermo or equivalent	B002000
96-well cell culture plates	Corning or equivalent	CLS3595
T150 cell culture flasks	Corning or equivalent	CLS430825
BSL-2 cell culture hood	Nuaire or equivalent	NU-540
300 mL robotic reservoirs	Thermo or equivalent	12-565-572
96 baffled automation reservoirs	Thermo or equivalent	1064-15-8
500 mL sterile disposable storage bottles	Corning or equivalent	CLS430282
Microplate heat sealer	Thermo or equivalent	AB-1443A
Microplate heat sealing foil	Thermo or equivalent	AB-0475
Cardamonin	Tocris or equivalent	2509	Anti-inflammatory, used as positive control
SKF 86002	Tocris or equivalent	2008	Anti-inflammatory, used as positive control
DMSO	Sigma or equivalent	D8418
48% hydrofluoric acid	Sigma or equivalent	339261	Corrosive and acute toxicity
1000 μL Single channel pipettors	Rainin or equivalent	17014382
200 μL Single channel pipettors	Rainin or equivalent	17014391
20 μL Single channel pipettors	Rainin or equivalent	17014392
1000 μL 12-channel pipettors	Rainin or equivalent	17014497
200 μL 12-channel pipettors	Rainin or equivalent	17013810
20 μL 12-channel pipettors	Rainin or equivalent	17013808
Pipettor tips 1000 μL	Rainin or equivalent	17002920
Pipettor tips 200 μL	Rainin or equivalent	17014294
Pipettor tips 20 μL	Rainin or equivalent	17002928
Chemical fume hood	Jamestown Metal Products	MHCO_229
384-well sample storage plates	Thermo or equivalent	262261
Sodium chloride	Sigma or equivalent	S6191
50 mL conical tubes	Thermo or equivalent	14-959-49A
Serological pipettes 50 mL	Corning or equivalent	07-200-576
Serological pipettes 25 mL	Corning or equivalent	07-200-575
Serological pipettes 10 mL	Corning or equivalent	07-200-574
Serological pipettes 5 mL	Corning or equivalent	07-200-573
SV40-HCEC immortalized human corneal epithelial cells	N/A	N/A	These cells are not commercially available, but can be obtained from the investigators cited in the article
Sceptor Handheld Automated Cell Counter	Millipore or equivalent	PHCC20060
GeneTitan Multi-Channel (MC) Instrument	Affymetrix or equivalent	00-0372
Affymetrix 24- and 96-array plates	Affymetrix or equivalent	901257; 901434
Draegger tube HF	Draeger or equivalent	8103251
Draegger tube CP	Draeger or equivalent	8103421
Draegger pump	Draeger or equivalent	6400000
Clear Plate seals	Resesarch Products International or Equivalent	202502
Reagent reservoirs	VistaLab Technologies or equivalent	3054-1000
Xlfit	IDBS or equivalent	N/A	Excel add-in used for automated curve fitting