High Throughput Screening de SiRNA para lesão de células epiteliais de cloropicrina e córnea induzida pelo fluoreto do hidrogênio
Summary
A triagem de RNA inibitória pequena de alta taxa de transferência é uma importante ferramenta que pode ajudar mais rapidamente elucidar os mecanismos moleculares da lesão epitelial de córnea química. Aqui, apresentamos o desenvolvimento e validação de modelos de exposição e métodos para o rastreio de alto rendimento de fluoreto de hidrogênio e cloropicrina-induzido por lesão epitelial de córnea.
Abstract
Lesão ocular induzida a toxicidade é uma verdadeira emergência ocular porque os produtos químicos têm o potencial para rapidamente infligir dano tecidual significativa. Tratamentos para toxicidade induzida por lesão da córnea são geralmente favorável como nenhuma terapêutica específica existe para tratar essas lesões. Nos esforços para desenvolver tratamentos e terapias para cuidar de exposição, pode ser importante para compreender os mecanismos moleculares e celulares destes ferimentos. Propomos que a utilização dos rastreio pequena de RNA (siRNA) inibitório alto throughput pode ser uma importante ferramenta que pode ajudar mais rapidamente elucidar os mecanismos moleculares da lesão epitelial de córnea química. siRNA são dobro encalhadas moléculas de RNA que são 19-25 nucleotides longos e utilizam o silenciamento caminho para degradar o mRNA do gene pós-transcricional que tem homologia com o siRNA. A redução resultante da expressão do gene específico em seguida pode ser estudada em células expostas tóxicas para verificar a função desse gene na resposta celular para a toxicidade. O desenvolvimento e validação de modelos de exposição em vitro e métodos para o alto throughput screening (HTS) de fluoreto de hidrogênio (HF) e cloropicrina-(CP) induzido por lesão ocular são apresentados neste artigo. Embora nós selecionamos essas duas substâncias tóxicas, nossos métodos são aplicáveis ao estudo de outras substâncias tóxicas, com pequenas modificações para o protocolo de exposição tóxica. O antígeno de T grande SV40 imortalizado SV40-HCEC foi selecionado para o estudo de linha de célula epitelial da córnea humana. Viabilidade celular e produção de IL-8 foram selecionados como pontos de extremidade no protocolo de triagem. Diversos desafios associados ao desenvolvimento de exposição tóxica e métodos de cultura celular adequados para estudos HTS são apresentados. Permite a criação de modelos HTS para estas substâncias tóxicas mais estudos entender melhor o mecanismo da lesão e a tela para terapêutica potencial para lesão ocular química.
Introduction
Lesão ocular induzida a toxicidade é uma verdadeira emergência ocular porque os produtos químicos têm o potencial para rapidamente infligir dano tecidual significativa. Infelizmente, tratamentos para toxicidade induzida por lesão da córnea só são geralmente favorável como nenhuma terapêutica específica existe para tratar essas lesões. A atual estratégia de tratamento é específico e principalmente inclui tratamentos terapêuticos tópicos tais como os lubrificantes, antibióticos, e cycloplegics seguido por anti-inflamatórios (por exemplo, esteroides) uma vez a córnea tem re-epithelialized1 ,2. Apesar das melhor tratamento terapêutico opções atuais disponíveis, prognóstico a longo prazo é geralmente pobre devido à turvação corneal progressiva e neovascularização2,3.
Modelos animais tem sido tradicionalmente usados para investigar a toxicidade química e compreender os mecanismos de lesão. No entanto, estudos em animais são demorado e caro. Existem também os esforços para reduzir a experimentação animal. Por exemplo, a legislação REACH (1907/2006 CE) na União Europeia tem disposições destinadas a reduzir a experimentação animal. As disposições incluem uma exigência que as empresas compartilham dados para evitar testes animais e obtenção de aprovação da Agência Europeia dos produtos químicos, antes de realizar os testes propostos em animais. Ao abrigo das disposições do REACH, a experimentação animal deve ser um último recurso. Há também o regulamento europeu de cosméticos (CE 1223/2009) que eliminadas a testes de cosméticos em animais. Quando são realizados estudos em animais, eles são guiados pelos princípios do 3Rs (refinamento, redução e substituição), que fornecem uma estrutura para a realização de pesquisas com animais mais humana, reduzindo o número de animais utilizados e usando alternativas não-animais sempre que possível. Por estas razões, o campo de toxicologia tem procurado adoptar em vitro ensaios que podem fornecer a introspecção do mecanismo molecular de toxicidade e podem ser feitos em maior taxa de transferência4. Esta é uma abordagem de toxicologia funcional onde substâncias tóxicas são definidas por sua função em vez de unicamente por sua química. Levou um passo adiante, funcional toxicogenomics procurar compreender as funções que desempenhar os efeitos de substâncias tóxicas5genes específicos. Com a aplicação da tecnologia siRNA, telas para investigar a função do gene nas respostas moleculares e celulares a substâncias tóxicas podem ser feitas com alto rendimento. siRNA são moléculas de RNA encalhadas dobro que são 19-25 nucleotides longos que aproveitar o post transcriptional gene silencioso caminho presente em todas as células de mamíferos6. Estes são sinteticamente feitos e projetados para atingir um gene específico. Quando introduzido em uma célula, o siRNA é processado e um fio, o fio guia, é carregado no complexo silencioso induzido por RNA (RISC). O siRNA direciona o RISC para uma região complementar em uma molécula de mRNA, e o RISC degrada o mRNA. Isso resulta na redução da expressão do gene específico. A redução resultante da expressão do gene específico em seguida pode ser estudada em células expostas tóxicas para verificar a função desse gene na resposta celular para a toxicidade. Esta abordagem tem sido usada para entender os mecanismos de susceptibilidade de ricina e a indução de AHR-dependente de CYP1A17,8.
A lista de avaliação de risco de terrorismo químico (CTRA) e as listas de produtos químicos industriais tóxicos (TIC) têm discriminados selecionados produtos químicos com base na sua toxicidade e potencial para ser liberado durante um terrorista, guerra ou acidente industrial evento9. Nós estamos aplicando um alto throughput de siRNA, abordagem de toxicogenomic (HTS) para o estudo de substâncias tóxicas de lista CTRA, que foram identificados com alto risco de utilização em um incidente terrorista de triagem. Toxicologia tradicional procura entender os efeitos adversos que produtos químicos em organismos vivos; no entanto, temos um desejo mais para entender os mecanismos de lesão com a finalidade de informar o desenvolvimento de abordagens terapêuticas e terapêutica e, possivelmente, descobrir moléculas que podem ser direcionadas para o desenvolvimento de terapêutico. Este esforço de certa forma pode ser considerado análogo ao uso de triagem de siRNA alto throughput e ensaios de célula com base na droga descoberta processo10. A principal diferença seria que essa descoberta de drogas normalmente procura um destino singular para descoberta terapêutica Considerando que em nossa abordagem é pouco provável que haja um destino singular com elevado valor terapêutico para o tratamento de exposição tóxica. Antecipamos que qualquer paradigma de tratamento eficaz para a exposição tóxica exigiria uma abordagem multi-facetada para alcançar alto valor terapêutico, e toxicogenomic dados vital podem informar uma paradigma de tratamento eficaz.
Automação de bancada traz metodologia alto throughput para laboratórios fora as indústrias farmacêuticas ou biotecnologia. Os estudos em vitro no nosso Instituto têm sido historicamente ensaios tradicionais que são de baixa taxa de transferência11,12,13. Nos últimos anos, nosso laboratório possui uma transição para o uso da robótica de bancada para realizar a triagem de siRNA alto throughput. Aqui, apresentamos o refinamento dos modelos de célula ocular e o desenvolvimento in vitro métodos de exposição para o fluoreto de hidrogênio (HF) e cloropicrina (CP) apropriada para triagem de siRNA alto throughput. Nosso objetivo é identificar as moléculas que regulam a lesão celular em resposta a essas substâncias tóxicas. Os alvos da biblioteca siRNA selecionados incluem receptores G proteína quinase de proteína, proteases, fosfatases, canais iônicos e outros alvos potencialmente druggable. HF e CP foram selecionados para o estudo por agentes de lista CTRA com os relatórios de ToxNet dos acidentes industriais a cruzar para encontrar aqueles que apresentam o maior risco de lesão ocular através do vapor exposição9,14. CP (fórmula química Cl3CNO2, número CAS 76-06-2) foi originalmente usado como um gás lacrimogêneo em WWI15. Atualmente é usado como um fumigante agrícola e funções como um inseticida, fungicida e nematicida16. Fluoreto de hidrogênio (HF) é usado em processos incluindo alquilação em refinarias de petróleo e fluoração eletroquímica de compostos orgânicos17. HF (fórmula química HF, número CAS 62778-11-4) é um gás, mas na sua forma aquosa é o ácido fluorídrico (HFA, CAS número 7664-39-3). Portanto, eleito para usar HFA em nosso celular em modelos de exposição. O antígeno de T grande SV40 imortalizado SV40-HCEC foi selecionado para o estudo de linha de célula epitelial da córnea humana. Viabilidade celular e o marcador inflamatório IL-8 foram selecionadas como pontos de extremidade alvos que estão envolvidos na lesão celular devem reflectir-se na morte celular e a resposta inflamatória. Especificamente, se o alvo fosse a desempenhar um papel protetor na exposição tóxica, morte celular e/ou produção de citocinas inflamatórias deve aumentar quando a expressão-alvo é inibida por siRNA. O contrário seria verdadeiro para alvos que desempenham um papel negativo. Além disso, inflamação crônica parece desempenhar um papel na patologia da córnea após exposição e intervenção em caminhos de morte celular podem melhorar os resultados clínicos2,18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste documento descrevemos nossos métodos e resultados no desenvolvimento de uma célula epitelial de alto throughput córnea triagem modelo para o estudo das lesões HF e CP. Também apresentamos os resultados a partir da tela de siRNA primário para lesão de HF. Havia muitos desafios para o desenvolvimento de modelos HTS para o estudo das lesões TIC. Métodos que encontramos na literatura relacionada ao estudo de HF, HFA ou CP em modelos de cultura de células foram de pouca ajuda. A maioria dos estudos em vitr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi apoiada pelo nacional institutos de saúde neutralizar programa interagências acordo # AOD13015-001. Gostaríamos de agradecer a Stephanie Froberg e Peter Hurst esforços e expertise na produção de vídeo.
Materials
| Bravo liquid handing platform | Agilent or equivalent | G5409A | |
| Bravo plate shaker | Agilent or equivalent | Option 159 | |
| Bravo 96LT disposable tip head | Agilent or equivalent | Option 178 | 96-channel large tip pipetting head unit |
| Bravo 96ST disposable tip head | Agilent or equivalent | Option 177 | 96-channel small tip pipetting head unit |
| Bravo 384ST disposable tip head | Agilent or equivalent | Option 179 | 384-channel small tip pipetting head unit |
| Bravo 96 250 μL sterile barrier tips | Agilent or equivalent | 19477-022 | |
| Bravo 384 30 μL sterile barrier tips | Agilent or equivalent | 19133-212 | |
| Bravo 384 70 μL sterile barrier tips | Agilent or equivalent | 19133-212 | |
| EnSpire multimode plate reader | Perkin Elmer or equivalent | 2300-0000 | AlphaLISA assay detector with high power laser excitation |
| IL-8 (human) AlphaLISA Detection Kit | Perkin Elmer or equivalent | AL224F | no-wash bead-based assay |
| ProxiPlate-384 Plus white 384-shallow well microplates | Perkin Elmer or equivalent | 6008359 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen or equivalent | 13778500 | Transfection reagent |
| Opti-MEM 1 Reduced Serum Medium | Invitrogen or equivalent | 31985070 | |
| TrypLE Express | Gibco or equivalent | 12605010 | Cell detachment solution |
| IncuCyte Zoom | Essen Instruments or equivalent | ESSEN BIOSCI 4473 | Incubator-housed automated microscope |
| Chloropicrin | Trinity Manufacturing or equivalent | N/A | Acute toxicity and irritant |
| DMEM-F12 cell culture medium | Invitrogen or equivalent | 11330-057 | Contains HEPES |
| Fetal bovine serum | Invitrogen or equivalent | 1891471 | |
| Human epidermal growth factor (cell culture grade) | Invitrogen or equivalent | E9644-.2MG | |
| Recombinant human insulin (cell culture grade) | Invitrogen or equivalent | 12585-014 | |
| Penicillin-Streptomycin solution (cell culture grade) | Invitrogen or equivalent | 15140122 | |
| Hydrocortisone (cell culture grade) | Sigma or equivalent | H0888-10G | |
| Glucose (cell culture grade) | Sigma or equivalent | G7021 | |
| PBS (cell culture grade) | Sigma or equivalent | P5493 | |
| siRNA | Dharmacon or equivalent | various | |
| Thiazolyl blue tetrazolium bromide | Sigma or equivalent | M5655 | MTT assay substrate |
| siRNA buffer | Thermo or equivalent | B002000 | |
| 96-well cell culture plates | Corning or equivalent | CLS3595 | |
| T150 cell culture flasks | Corning or equivalent | CLS430825 | |
| BSL-2 cell culture hood | Nuaire or equivalent | NU-540 | |
| 300 mL robotic reservoirs | Thermo or equivalent | 12-565-572 | |
| 96 baffled automation reservoirs | Thermo or equivalent | 1064-15-8 | |
| 500 mL sterile disposable storage bottles | Corning or equivalent | CLS430282 | |
| Microplate heat sealer | Thermo or equivalent | AB-1443A | |
| Microplate heat sealing foil | Thermo or equivalent | AB-0475 | |
| Cardamonin | Tocris or equivalent | 2509 | Anti-inflammatory, used as positive control |
| SKF 86002 | Tocris or equivalent | 2008 | Anti-inflammatory, used as positive control |
| DMSO | Sigma or equivalent | D8418 | |
| 48% hydrofluoric acid | Sigma or equivalent | 339261 | Corrosive and acute toxicity |
| 1000 μL Single channel pipettors | Rainin or equivalent | 17014382 | |
| 200 μL Single channel pipettors | Rainin or equivalent | 17014391 | |
| 20 μL Single channel pipettors | Rainin or equivalent | 17014392 | |
| 1000 μL 12-channel pipettors | Rainin or equivalent | 17014497 | |
| 200 μL 12-channel pipettors | Rainin or equivalent | 17013810 | |
| 20 μL 12-channel pipettors | Rainin or equivalent | 17013808 | |
| Pipettor tips 1000 μL | Rainin or equivalent | 17002920 | |
| Pipettor tips 200 μL | Rainin or equivalent | 17014294 | |
| Pipettor tips 20 μL | Rainin or equivalent | 17002928 | |
| Chemical fume hood | Jamestown Metal Products | MHCO_229 | |
| 384-well sample storage plates | Thermo or equivalent | 262261 | |
| Sodium chloride | Sigma or equivalent | S6191 | |
| 50 mL conical tubes | Thermo or equivalent | 14-959-49A | |
| Serological pipettes 50 mL | Corning or equivalent | 07-200-576 | |
| Serological pipettes 25 mL | Corning or equivalent | 07-200-575 | |
| Serological pipettes 10 mL | Corning or equivalent | 07-200-574 | |
| Serological pipettes 5 mL | Corning or equivalent | 07-200-573 | |
| SV40-HCEC immortalized human corneal epithelial cells | N/A | N/A | These cells are not commercially available, but can be obtained from the investigators cited in the article |
| Sceptor Handheld Automated Cell Counter | Millipore or equivalent | PHCC20060 | |
| GeneTitan Multi-Channel (MC) Instrument | Affymetrix or equivalent | 00-0372 | |
| Affymetrix 24- and 96-array plates | Affymetrix or equivalent | 901257; 901434 | |
| Draegger tube HF | Draeger or equivalent | 8103251 | |
| Draegger tube CP | Draeger or equivalent | 8103421 | |
| Draegger pump | Draeger or equivalent | 6400000 | |
| Clear Plate seals | Resesarch Products International or Equivalent | 202502 | |
| Reagent reservoirs | VistaLab Technologies or equivalent | 3054-1000 | |
| Xlfit | IDBS or equivalent | N/A | Excel add-in used for automated curve fitting |
References
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