High Throughput Screening de SiRNA para lesão de células epiteliais de cloropicrina e córnea induzida pelo fluoreto do hidrogênio

Resumo

A triagem de RNA inibitória pequena de alta taxa de transferência é uma importante ferramenta que pode ajudar mais rapidamente elucidar os mecanismos moleculares da lesão epitelial de córnea química. Aqui, apresentamos o desenvolvimento e validação de modelos de exposição e métodos para o rastreio de alto rendimento de fluoreto de hidrogênio e cloropicrina-induzido por lesão epitelial de córnea.

Resumo

Lesão ocular induzida a toxicidade é uma verdadeira emergência ocular porque os produtos químicos têm o potencial para rapidamente infligir dano tecidual significativa. Tratamentos para toxicidade induzida por lesão da córnea são geralmente favorável como nenhuma terapêutica específica existe para tratar essas lesões. Nos esforços para desenvolver tratamentos e terapias para cuidar de exposição, pode ser importante para compreender os mecanismos moleculares e celulares destes ferimentos. Propomos que a utilização dos rastreio pequena de RNA (siRNA) inibitório alto throughput pode ser uma importante ferramenta que pode ajudar mais rapidamente elucidar os mecanismos moleculares da lesão epitelial de córnea química. siRNA são dobro encalhadas moléculas de RNA que são 19-25 nucleotides longos e utilizam o silenciamento caminho para degradar o mRNA do gene pós-transcricional que tem homologia com o siRNA. A redução resultante da expressão do gene específico em seguida pode ser estudada em células expostas tóxicas para verificar a função desse gene na resposta celular para a toxicidade. O desenvolvimento e validação de modelos de exposição em vitro e métodos para o alto throughput screening (HTS) de fluoreto de hidrogênio (HF) e cloropicrina-(CP) induzido por lesão ocular são apresentados neste artigo. Embora nós selecionamos essas duas substâncias tóxicas, nossos métodos são aplicáveis ao estudo de outras substâncias tóxicas, com pequenas modificações para o protocolo de exposição tóxica. O antígeno de T grande SV40 imortalizado SV40-HCEC foi selecionado para o estudo de linha de célula epitelial da córnea humana. Viabilidade celular e produção de IL-8 foram selecionados como pontos de extremidade no protocolo de triagem. Diversos desafios associados ao desenvolvimento de exposição tóxica e métodos de cultura celular adequados para estudos HTS são apresentados. Permite a criação de modelos HTS para estas substâncias tóxicas mais estudos entender melhor o mecanismo da lesão e a tela para terapêutica potencial para lesão ocular química.

Introdução

Lesão ocular induzida a toxicidade é uma verdadeira emergência ocular porque os produtos químicos têm o potencial para rapidamente infligir dano tecidual significativa. Infelizmente, tratamentos para toxicidade induzida por lesão da córnea só são geralmente favorável como nenhuma terapêutica específica existe para tratar essas lesões. A atual estratégia de tratamento é específico e principalmente inclui tratamentos terapêuticos tópicos tais como os lubrificantes, antibióticos, e cycloplegics seguido por anti-inflamatórios (por exemplo, esteroides) uma vez a córnea tem re-epithelialized^{1 ,2}. Apesar da....

Protocolo

1. manutenção de cultura celular

1. Crescer a linha de celular SV40-HCEC a 37 ° C, 5% CO₂e 90% de umidade em DMEM F-12 com 15% de soro fetal bovino (FBS), 1% L-glutamina, µ g/L 10 fator de crescimento epidérmico (EGF) e insulina 5mg/L.
2. Passagem da linhagem celular a cada 3 a 4 dias (dependendo da densidade de semeadura) para garantir que a confluência nunca excede 80% durante a manutenção da cultura.
3. Separe as células de balões usando uma solução de destacamento (solução de 14 mL para cada frasco de² 150 cm) e incubação a 37 ° C para não mais do que 8 min.
4. Neutralizar a solução de desprendimento com igual volu....

Resultados

Desenvolvimento do método de exposição

Nós refinado e avaliamos a adequação da linha de células epiteliais da córnea humana SV40-HCEC para uso em estudos HTS. SV40-HCEC foram imortalizados usando o antígeno de T grande SV-40 e foi um presente do amigo Dhanajay²³. Havia muitas variáveis exploradas no desenvolvimento de metodologia de exposição para apresentar de forma concisa neste documen.......

Discussão

Neste documento descrevemos nossos métodos e resultados no desenvolvimento de uma célula epitelial de alto throughput córnea triagem modelo para o estudo das lesões HF e CP. Também apresentamos os resultados a partir da tela de siRNA primário para lesão de HF. Havia muitos desafios para o desenvolvimento de modelos HTS para o estudo das lesões TIC. Métodos que encontramos na literatura relacionada ao estudo de HF, HFA ou CP em modelos de cultura de células foram de pouca ajuda. A maioria dos estudos em vitro no .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Plataforma de manuseio de líquidos Bravo	Agilent ou equivalente	G5409A
Agitador de placas Bravo	Agilent ou equivalente	Opção 159
Cabeça de ponta descartável Bravo 96LT	Agilent ou equivalente	Opção 178	Unidade de cabeça de pipetagem de ponta grande de 96 canais
Cabeça de ponta descartável Bravo 96ST	Agilent ou equivalente	Opção 177	Pipetagem de ponta pequena de 96 canais unidade principal
Bravo 384ST cabeça de ponta descartável	Agilent ou equivalente	Opção 179	Unidade principal de pipetagem de ponta pequena de 384 canais
Bravo 96 250 μ L pontas de barreira estéreis	Agilent ou equivalente	19477-022
Bravo 384 30 μ L pontas de barreira estéreis	Agilent ou equivalente	19133-212
Bravo 384 70 μ L pontas de barreira estéreis	Agilent ou equivalente	19133-212
EnSpire leitor de placas multimodo	Perkin Elmer ou equivalente	2300-0000	Detector de ensaio AlphaLISA com excitação a laser de alta potência
IL-8 (humano) Kit de Detecção AlphaLISA	Perkin Elmer ou equivalente	AL224F	ensaio baseado em esferas sem lavagem
ProxiPlate-384 Plus microplacas brancas de 384 poços rasos	Perkin Elmer ou equivalente	6008359
Lipofectamina RNAiMAX	Invitrogen ou equivalente	13778500	Reagente de transfecção
Opti-MEM 1 Meio de soro reduzido	Invitrogen ou equivalente	31985070
TrypLE Express	Gibco ou equivalente	12605010	Solução de desprendimento de células
IncuCyte Zoom	Essen Instruments ou equivalente	ESSEN BIOSCI 4473	Microscópio automatizado alojado em incubadora
Cloropicrina	Trinity Manufacturing ou equivalente	N/A	Toxicidade aguda e irritante
Meio de cultura de células DMEM-F12	Invitrogen ou equivalente	11330-057	Contém HEPES
Soro fetal bovino	Invitrogen ou equivalente	1891471 Fator de
crescimento epidérmico humano (grau de cultura de células)	Invitrogen ou equivalente	E9644-.2MG
Insulina humana recombinante (grau de cultura de células)	Invitrogen ou equivalente	12585-014
Solução de penicilina-estreptomicina (grau de cultura de células)	Invitrogen ou equivalente	15140122
Hidrocortisona (grau de cultura celular)	Sigma ou equivalente	H0888-10G
Glicose  (grau de cultura celular)	Sigma ou equivalente	G7021
PBS  (grau de cultura celular)	Sigma ou equivalente	P5493
siRNA	Dharmacon ou equivalente	vários
brometo de tetrazólio azul de tiazolila	Sigma ou equivalente	M5655	MTT substrato
de ensaio tampão siRNA	Thermo ou equivalente	B002000
placas de cultura de células de 96 poços	Corning ou equivalente	CLS3595
cultura de células T150 frascos	Corning ou equivalente	CLS430825
capa de cultura de células BSL-2	Nuaire ou equivalente	NU-540
300 mL reservatórios robóticos	Thermo ou equivalente	12-565-572
96 reservatórios de automação defletores	Thermo ou equivalente	1064-15-8
Garrafas de armazenamento descartáveis estéreis de 500 mL	Corning ou equivalente	CLS430282
Seladora térmica de microplacas	Thermo ou equivalente	AB-1443A
Folha de selagem a quente de microplacas	Thermo ou equivalente	AB-0475
Cardamonina	Tocris ou equivalente	2509	Anti-inflamatório, usado como controle positivo
SKF 86002	Tocris ou equivalente	2008	Anti-inflamatório, usado como controle positivo
DMSO	Sigma ou equivalente	D8418
48% ácido fluorídrico	Sigma ou equivalente	339261	Toxicidade corrosiva e aguda
1000 μ L Pipetadores monocanal	Rainin ou equivalente	17014382
200 μ L Pipetadores de canal único	Rainin ou equivalente	17014391
20 μ L Pipetadores de canal único	Rainin ou equivalente	17014392
1000 μ L pipetadores de 12 canais	Rainin ou equivalente	17014497
200 μ L Pipetadores de 12 canais	Rainin ou equivalente	17013810
20 μ L Pipetadores de 12 canais	Rainin ou equivalente	17013808
Pontas de pipetador 1000 μ L	Rainin ou equivalente	17002920
pontas de pipetador 200 μ L	Rainin ou equivalente	17014294
pontas de pipetador 20 μ L	Rainin ou equivalente	17002928
Capela-exaustão química	Jamestown Metal Products	MHCO_229
Placas de armazenamento de amostras de 384 poços	Termo-líquido ou equivalente	262261
Cloreto de sódio	Sigma ou equivalente	S6191
Tubos cônicos de 50 mL		14-959-49A
50 mL	Corning ou equivalente	07-200-576
Pipetas sorológicas 25 mL	Corning ou equivalente	07-200-575
Pipetas sorológicas 10 mL	Corning ou equivalente	07-200-574
Pipetas sorológicas 5 mL	Corning ou equivalente	07-200-573
SV40-HCEC células epiteliais da córnea humana imortalizadas	N/A	N/A	Essas células não estão disponíveis comercialmente, mas podem ser obtidas com os investigadores citados no artigo
Sceptor Handheld Automated Cell Counter	Millipore ou equivalente	PHCC20060
GeneTitan Multi-Channel (MC) Instrument	Affymetrix ou equivalente	00-0372
Affymetrix placas de 24 e 96 matrizes	Affymetrix ou equivalente	901257; 901434
Draegger tubo HF	Draeger ou equivalente	8103251
Tubo Draegger CP	Draeger ou equivalente	8103421
Bomba Draegger	Draeger ou equivalente	6400000
Vedações de placa transparente	Resesarch Products International ou equivalente	202502
Reservatórios de reagentes	VistaLab Technologies ou equivalente	3054-1000
Xlfit	IDBS ou suplemento equivalente	N/A	Excel usado para ajuste automatizado de curvas

Termo-959-49A Pipetas sorológicas