Hoher Durchsatz SiRNA Screening für Chlorpikrin und Fluorwasserstoff-induzierte Hornhaut Epithelzelle Verletzungen

Summary

Hoher Durchsatz kleine hemmende RNA-Screening ist ein wichtiges Instrument, das dazu beitragen könnten, um die molekularen Mechanismen der chemischen Hornhaut epithelialen Verletzungen schneller zu erhellen. Hier präsentieren wir Ihnen die Entwicklung und Validierung der Expositionsmodelle und Methoden für das Hochdurchsatz-Screening von Fluorwasserstoff und Chlorpikrin induzierte Hornhaut epitheliale Schädigung.

Abstract

Schlüpfzeit-induzierte augenfällige Verletzungen ist ein wahre okuläre Notfall weil Chemikalien das Potenzial haben, schnell erheblichen Gewebeschäden verursachen. Behandlungen für Schlüpfzeit-induzierte Verletzung der Hornhaut sind generell unterstützt, da es keine spezifische Therapie gibt um diese Verletzungen zu behandeln. Bei den Bemühungen um Behandlungen und Therapeutika zur Betreuung der Exposition zu entwickeln kann es wichtig zu verstehen, die molekularen und zellulären Mechanismen dieser Verletzungen sein. Schlagen wir die Nutzung der hohen Durchsatz kleine hemmende RNA (SiRNA) Screening ein wichtiges Instrument sein kann, das dazu beitragen könnten, um die molekularen Mechanismen der chemischen Hornhaut epithelialen Verletzungen schneller zu erhellen. SiRNA sind doppelte gestrandete RNA-Moleküle, die 19-25 Nukleotide lang und nutzen die posttranskriptionelle gen-silencing Weg, um mRNA zu degradieren die Homologie, die SiRNA haben. Die daraus resultierende Verringerung der Expression von bestimmten Genen kann dann im vergiftendes exponierten Zellen zu prüfen, die Funktion dieses Gens in die zelluläre Antwort auf die Schlüpfzeit untersucht werden. Die Entwicklung und Validierung von in-vitro- Expositionsmodelle und Methoden für die Hochdurchsatz-screening (HTS) von Fluorwasserstoff (HF) und Chlorpikrin-(CP) induzierte augenfällige Verletzungen werden in diesem Artikel vorgestellt. Obwohl wir diese zwei Giftstoffe ausgewählt haben, sind unsere Methoden auf die Studie von anderen Schadstoffen mit geringfügigen Änderungen des Protokolls vergiftendes Exposition anwendbar. Das SV40 große T Antigen verewigt menschlichen Hornhaut epithelialen Zellinie SV40-HCEC für die Studie ausgewählt wurde. Zellviabilität und IL-8 Produktion wurden als Endpunkte in der Screening-Protokoll ausgewählt. Mehrere Herausforderungen im Zusammenhang mit der Entwicklung von giftigen Belichtung und Zelle Kulturmethoden geeignet für HTS-Studien werden präsentiert. Die Einrichtung von HTS-Modelle für diese Giftstoffe kann für weitere Studien, den Mechanismus der Schädigung und zum Bildschirm für potenzielle Therapeutika für chemische augenfällige Verletzungen besser zu verstehen.

Introduction

Schlüpfzeit-induzierte augenfällige Verletzungen ist ein wahre okuläre Notfall weil Chemikalien das Potenzial haben, schnell erheblichen Gewebeschäden verursachen. Leider sind Behandlungen für Schlüpfzeit-induzierte Verletzung der Hornhaut nur generell unterstützt, da es keine spezifische Therapie gibt um diese Verletzungen zu behandeln. Die aktuellen Behandlungsstrategie ist unspezifisch und umfasst in erster Linie topische Therapien wie Schmierstoffe, Antibiotika, und Cycloplegics gefolgt von Antiphlogistika (z.B. Steroide) einmal die Hornhaut hat wieder epithelialized^{1 ,2}. Trotz der besten aktuellen therapeutischen Behandlungsmöglichkeiten zur Verfügung ist Langzeit-Prognose im Allgemeinen schlecht durch progressive Trübung der Hornhaut und Neovaskularisation^2,3.

Tiermodelle haben traditionell verwendet, um chemische Toxizität zu untersuchen und Mechanismen der Schädigung zu verstehen. Tierversuche sind jedoch zeitaufwendig und teuer. Auch gibt es Bestrebungen, Tierversuche zu reduzieren. REACH-Verordnung (EG 1907/2006) in der Europäischen Union hat beispielsweise Vorschriften zur Tierversuche reduzieren. Die Bestimmungen enthalten die Forderung, dass Firmen Daten austauschen, zur Vermeidung von tierischen Prüfung und Billigung der Europäischen Chemikalien Agentur vor dem vorgeschlagenen Tests an Tieren durchführen. Gemäß den Bestimmungen der REACH-Verordnung sollten Tierversuche ein letztes Mittel sein. Außerdem gibt es die Europäische Kosmetik-Verordnung (EG 1223/2009), die die Tests von Kosmetika an Tieren auslaufen. Wenn Tierversuche durchgeführt werden, sie orientieren sich an den Grundsätzen der 3R (Verfeinerung, Minderung und Ersatz), die einen Rahmen für humanere Tierversuche durchführen, Verringerung der Zahl der verwendeten Tiere und mit tierversuchsfreien Alternativen bieten wo möglich. Aus diesen Gründen hat das Gebiet der Toxikologie versucht, in-vitro- Assays beschließen, die können Einblick in die molekularen Mechanismen der Toxizität und kann in höheren Durchsatz⁴durchgeführt werden. Dies ist ein funktioneller Toxikologie Ansatz, wo Giftstoffe werden durch ihre Funktion nicht allein durch ihre Chemie definiert. Genommen einen Schritt weiter, funktionelle basolaterale versuchen, die Rollen zu verstehen, die bestimmte Gene in den Effekten von Schadstoffen⁵spielen. Mit der Anwendung der SiRNA-Technologie können bei hohem Durchsatz Bildschirme Genfunktion in der molekularen und zellulären Reaktionen auf Giftstoffe untersuchen erfolgen. SiRNA sind doppelte gestrandete RNA-Moleküle, die 19-25 Nukleotide lang, das Nutzen der Post transkriptionellen Gen-Silencing-Weg in allen Säugetierzellen⁶vorhanden sind. Diese sind synthetisch hergestellt und entwickelt, um ein bestimmtes Gen Ziel. Die SiRNA wird verarbeitet, wenn Sie in einer Zelle eingeführt, und ein Strang, der Führer-Strang in der RNA-induced silencing-Komplex (RISC) geladen wird. Die SiRNA lenkt das Risiko auf eine ergänzende Region in einem mRNA-Molekül und die RISC verschlechtert die mRNA. Dies führt bei der Verringerung der Expression von bestimmten Genen. Die daraus resultierende Verringerung der Expression von bestimmten Genen kann dann im vergiftendes exponierten Zellen zu prüfen, die Funktion dieses Gens in die zelluläre Antwort auf die Schlüpfzeit untersucht werden. Ein solcher Ansatz wurde verwendet, um weiter zu verstehen, die Mechanismen der Ricin Anfälligkeit und die AHR-abhängige Induktion von CYP1A1^7,8.

Die chemische Terrorismus Risk Assessment (CTRA) Liste und toxische Industriechemikalien (TIC) Inserate haben ausgewählte Chemikalien aufgrund ihrer Toxizität und Potenzial, während ein Terrorist, Kriegsführung oder Arbeitsunfall Event⁹freigegeben werden aufgeschlüsselt. Wir wenden eine SiRNA Hochdurchsatz screening (HTS) toxikogenomische Ansatz für die Untersuchung von CTRA Liste Schadstoffen, die mit hohem Risiko für Gebrauch in einem terroristischen Anschlags sein identifiziert wurden. Traditionelle Toxikologie versucht, die negativen Auswirkungen zu verstehen, die Chemikalien auf lebende Organismen haben; Allerdings haben wir einen weiteren Wunsch zu verstehen, die Mechanismen der Schädigung zur Information der Entwicklung von Therapeutika und therapeutische Ansätze und möglicherweise, entdecken Sie Moleküle, die für die therapeutische Entwicklung ausgerichtet werden können. Diese Anstrengung in gewisser Weise kann analog zu den Einsatz von Hochdurchsatz-SiRNA-Screening und zellbasierte Assays in Drug Discovery Prozess¹⁰angesehen werden. Ein wesentlicher Unterschied wäre, dass diese Drogeentdeckung in der Regel ein einzigartiges Ziel für therapeutische Entdeckung sucht, in unserem Ansatz ist es eher unwahrscheinlich, daß wäre ein einzigartiges Ziel mit hohem therapeutischen Wert für die Behandlung von giftigen Belichtung. Wir gehen davon aus, dass wirksame behandlungsparadigma für vergiftendes Exposition einen vielschichtigen Ansatz erfordern würde, hohen therapeutischen Wert zu erreichen, und toxikogenomischen Daten können eine wirksame behandlungsparadigma von entscheidender informieren.

Benchtop Automatisierung bringt Hochdurchsatz-Methodik in Laboratorien außerhalb der Pharma- oder Biotech-Industrie. Die in-vitro- Studien an unserem Institut wurden historisch traditioneller Assays sind niedriger Durchsatz^11,12,13. In den letzten Jahren hat unser Labor die Verwendung der Benchtop-Robotik, hoher Durchsatz SiRNA Screening durchzuführen umgestellt. Hier präsentieren wir die Verfeinerung der okulären zellmodelle und die Entwicklung von in-vitro- Belichtungsmethoden für Fluorwasserstoff (HF) und Chlorpikrin (CP) für hohen Durchsatz SiRNA Screening geeignet. Unser Ziel ist es, Moleküle zu identifizieren, die zelluläre Verletzungen als Reaktion auf diese Giftstoffe zu regulieren. Die SiRNA-Bibliothek von die uns ausgewählten Gehören G-Protein-gekoppelten Rezeptoren, Proteinkinasen, Proteasen, Phosphatasen, Ionenkanäle und andere potenziell druggable Ziele. HF und CP wurden für die Studie von Querverweise CTRA Liste Agenten mit den ToxNet Berichten von Arbeitsunfällen, diejenigen zu finden, die das größte Risiko der okulären Verletzung über Dampf Exposition^9,14präsentieren. CP (chemische Formel Cl₃CNO₂, CAS-Nummer 76-06-2) wurde ursprünglich als ein Tränengas in WWI¹⁵verwendet. Es wird derzeit als eine landwirtschaftliche Räuchermittel und Funktionen als ein Nematizide, Fungizid und Insektizid¹⁶verwendet. Fluorwasserstoff (HF) wird in Prozesse einschließlich der Alkylierung in Ölraffinerien und elektrochemische Fluorierung von organischen Verbindungen¹⁷verwendet. HF (chemische Formel HF, CAS-Nummer 62778-11-4) ist ein Gas, aber in ihrer wässrigen Form ist Flusssäure (HFA, CAS Nr. 7664-39-3). Daher wir gewählt, um HFA in unserer in Zelle Expositionsmodelle. Das SV40 große T Antigen verewigt menschlichen Hornhaut epithelialen Zellinie SV40-HCEC für die Studie ausgewählt wurde. Zellviabilität und entzündlichen Marker IL-8 wurden als Endpunkte ausgewählt, weil Ziele, die zelluläre Verletzungen beteiligt sind in den Zelltod und die entzündliche Reaktion niederschlagen sollte. Insbesondere sollte ein Ziel in vergiftendes Exposition eine schützende Rolle spielen, sollten Zelltod und/oder Produktion von inflammatorischen Zytokinen erhöhen, wenn der Zielausdruck von SiRNA gehemmt wird. Das Gegenteil wäre auch für Ziele, die eine negative Rolle spielen. Chronischer Entzündung scheint auch eine Rolle in der Pathologie der Hornhaut nach Exposition und Intervention in der Zelle Tod wegen Therapieergebnis^2,18verbessern kann.

Protocol

(1) Zelle Kultur Wartung Wachsen die Zellinie SV40-HCEC bei 37 ° C, 5 % CO2und 90 % Luftfeuchtigkeit in DMEM F-12 mit 15 % fetalen bovine Serum (FBS), 1 % L-Glutamin, 10 µg/L epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) und 5 mg/L Insulin. Durchgang der Zell-Linie alle 3 bis 4 Tage (je nach Aussaatdichte) um sicherzustellen, dass Konfluenz nie größer 80 % bei der Wartung der Kultur als. Die Zellen von Flaschen mit einem Detachement (14 mL Lösung für jede 150 cm2 Kolben) und …

Representative Results

Exposition Methodenentwicklung Wir verfeinert und die Eignung der menschlichen Hornhaut epithelialen Zellinie SV40-HCEC für HTS Studien ausgewertet. SV40-HCEC waren mit dem SV-40 große T Antigen verewigt und waren ein Geschenk von Dhanajay Pal23. Gab es zu viele Variablen in Exposition Methodik Entwicklung prägnant hierin präsentieren erforscht, und so, nur einige Beispiele für Ergeb…

Discussion

Hier beschreiben wir unsere Methoden und Ergebnisse über die Entwicklung des einen hohen Durchsatz Hornhaut Epithelzelle screening-Modell für die Untersuchung von HF und CP Verletzungen. Außerdem präsentieren wir die Ergebnisse aus dem primären SiRNA-Bildschirm für HF-Verletzungen. Es gab viele Herausforderungen an die Entwicklung der HTS-Modelle für die Untersuchung von TIC Verletzungen. Methoden, die wir in der Literatur im Zusammenhang mit der Studie von HF, HFA oder CP in zellmodellen Kultur finden konnte ware…

Materials

Bravo liquid handing platform	Agilent or equivalent	G5409A
Bravo plate shaker	Agilent or equivalent	Option 159
Bravo 96LT disposable tip head	Agilent or equivalent	Option 178	96-channel large tip pipetting head unit
Bravo 96ST disposable tip head	Agilent or equivalent	Option 177	96-channel small tip pipetting head unit
Bravo 384ST disposable tip head	Agilent or equivalent	Option 179	384-channel small tip pipetting head unit
Bravo 96 250 μL sterile barrier tips	Agilent or equivalent	19477-022
Bravo 384 30 μL sterile barrier tips	Agilent or equivalent	19133-212
Bravo 384 70 μL sterile barrier tips	Agilent or equivalent	19133-212
EnSpire multimode plate reader	Perkin Elmer or equivalent	2300-0000	AlphaLISA assay detector with high power laser excitation
IL-8 (human) AlphaLISA Detection Kit	Perkin Elmer or equivalent	AL224F	no-wash bead-based assay
ProxiPlate-384 Plus white 384-shallow well microplates	Perkin Elmer or equivalent	6008359
Lipofectamine RNAiMAX	Invitrogen or equivalent	13778500	Transfection reagent
Opti-MEM 1 Reduced Serum Medium	Invitrogen or equivalent	31985070
TrypLE Express	Gibco or equivalent	12605010	Cell detachment solution
IncuCyte Zoom	Essen Instruments or equivalent	ESSEN BIOSCI 4473	Incubator-housed automated microscope
Chloropicrin	Trinity Manufacturing or equivalent	N/A	Acute toxicity and irritant
DMEM-F12 cell culture medium	Invitrogen or equivalent	11330-057	Contains HEPES
Fetal bovine serum	Invitrogen or equivalent	1891471
Human epidermal growth factor (cell culture grade)	Invitrogen or equivalent	E9644-.2MG
Recombinant human insulin (cell culture grade)	Invitrogen or equivalent	12585-014
Penicillin-Streptomycin solution (cell culture grade)	Invitrogen or equivalent	15140122
Hydrocortisone (cell culture grade)	Sigma or equivalent	H0888-10G
Glucose  (cell culture grade)	Sigma or equivalent	G7021
PBS  (cell culture grade)	Sigma or equivalent	P5493
siRNA	Dharmacon or equivalent	various
Thiazolyl blue tetrazolium bromide	Sigma or equivalent	M5655	MTT assay substrate
siRNA buffer	Thermo or equivalent	B002000
96-well cell culture plates	Corning or equivalent	CLS3595
T150 cell culture flasks	Corning or equivalent	CLS430825
BSL-2 cell culture hood	Nuaire or equivalent	NU-540
300 mL robotic reservoirs	Thermo or equivalent	12-565-572
96 baffled automation reservoirs	Thermo or equivalent	1064-15-8
500 mL sterile disposable storage bottles	Corning or equivalent	CLS430282
Microplate heat sealer	Thermo or equivalent	AB-1443A
Microplate heat sealing foil	Thermo or equivalent	AB-0475
Cardamonin	Tocris or equivalent	2509	Anti-inflammatory, used as positive control
SKF 86002	Tocris or equivalent	2008	Anti-inflammatory, used as positive control
DMSO	Sigma or equivalent	D8418
48% hydrofluoric acid	Sigma or equivalent	339261	Corrosive and acute toxicity
1000 μL Single channel pipettors	Rainin or equivalent	17014382
200 μL Single channel pipettors	Rainin or equivalent	17014391
20 μL Single channel pipettors	Rainin or equivalent	17014392
1000 μL 12-channel pipettors	Rainin or equivalent	17014497
200 μL 12-channel pipettors	Rainin or equivalent	17013810
20 μL 12-channel pipettors	Rainin or equivalent	17013808
Pipettor tips 1000 μL	Rainin or equivalent	17002920
Pipettor tips 200 μL	Rainin or equivalent	17014294
Pipettor tips 20 μL	Rainin or equivalent	17002928
Chemical fume hood	Jamestown Metal Products	MHCO_229
384-well sample storage plates	Thermo or equivalent	262261
Sodium chloride	Sigma or equivalent	S6191
50 mL conical tubes	Thermo or equivalent	14-959-49A
Serological pipettes 50 mL	Corning or equivalent	07-200-576
Serological pipettes 25 mL	Corning or equivalent	07-200-575
Serological pipettes 10 mL	Corning or equivalent	07-200-574
Serological pipettes 5 mL	Corning or equivalent	07-200-573
SV40-HCEC immortalized human corneal epithelial cells	N/A	N/A	These cells are not commercially available, but can be obtained from the investigators cited in the article
Sceptor Handheld Automated Cell Counter	Millipore or equivalent	PHCC20060
GeneTitan Multi-Channel (MC) Instrument	Affymetrix or equivalent	00-0372
Affymetrix 24- and 96-array plates	Affymetrix or equivalent	901257; 901434
Draegger tube HF	Draeger or equivalent	8103251
Draegger tube CP	Draeger or equivalent	8103421
Draegger pump	Draeger or equivalent	6400000
Clear Plate seals	Resesarch Products International or Equivalent	202502
Reagent reservoirs	VistaLab Technologies or equivalent	3054-1000
Xlfit	IDBS or equivalent	N/A	Excel add-in used for automated curve fitting