Høy gjennomstrømning SiRNA Screening for Chloropicrin og fluor-indusert hornhinnen Epithelial celle skade

Summary

Høy gjennomstrømning liten hemmende RNA screening er et viktig verktøy som kan bidra til raskere belyse molekylære mekanismer av kjemiske hornhinnen epithelial skade. Her presenterer vi utvikling og validering av eksponering modeller og metoder for høy gjennomstrømning screening av fluor – og chloropicrin-indusert hornhinnen epithelial skade.

Abstract

Toxicant-indusert okulær skade er en sann okulær krise siden kjemikalier har potensial til å raskt påføre betydelig vevsskade. Behandlinger for toxicant-indusert hornhinnen skade er generelt støttende som ingen bestemt therapeutics eksisterer for å behandle disse skader. I arbeidet med å utvikle behandlinger og therapeutics å omsorg for eksponering, kan det være viktig å forstå molekylære og cellulære mekanismer for disse skader. Vi foreslår at utnyttelse av høy gjennomstrømning liten hemmende RNA (siRNA) screening kan være et viktig verktøy som kan bidra til raskere belyse molekylære mekanismer av kjemiske hornhinnen epithelial skade. siRNA er dobbel strandet RNA molekyler som er 19-25 nukleotider lang og utnytte post-transcriptional genet stanse sti å svekke mRNA som har homologi til siRNA. Den resulterende reduksjonen av uttrykk for bestemte genet kan deretter studeres i toxicant eksponert cellene for å fastslå funksjonen av det genet i cellulær respons til toxicant. Utvikling og validering av i vitro eksponering modeller og metoder for den høy gjennomstrømningen screening (HTS) fluor-(HF) og chloropicrin-(CP) indusert okulær skade presenteres i denne artikkelen. Selv om vi valgte disse to giftstoffer, er våre metoder aktuelt å studere andre giftstoffer med små endringer i toxicant eksponering-protokollen. SV40 store T antigen udødeliggjort menneskelig hornhinnen epithelial celle linje SV40-HCEC ble valgt for studien. Cellen levedyktighet og IL-8 produksjon ble valgt som endepunktene i screening-protokollen. Flere utfordringer knyttet til utviklingen av toxicant eksponering og celle kultur metoder egnet for HTS studier presenteres. Etableringen av HTS modeller for disse giftstoffer lar for videre studier for å bedre forstå mekanismen av skade og skjermen for potensielle legemiddelselskap for kjemiske okulær skade.

Introduction

Toxicant-indusert okulær skade er en sann okulær krise siden kjemikalier har potensial til å raskt påføre betydelig vevsskade. Dessverre er behandlinger for toxicant-indusert hornhinnen skade bare generelt støttende som ingen bestemt therapeutics eksisterer for å behandle disse skader. Den nåværende behandling strategien er uspesifikke og primært inneholder aktuelle terapeutiske behandlinger som smøremidler, antibiotika, og cycloplegics etterfulgt av anti-inflammatories (f.eks, steroider) når hornhinnen har nytt epithelialized^{1 ,2}. Til tross for de beste nåværende terapeutiske behandlingstilbud tilgjengelig er langsiktige prognosen dårlig progressiv hornhinnen clouding og neovascularization^2,3.

Dyremodeller har tradisjonelt brukt til å undersøke kjemiske giftighet og forstå mekanismene for skade. Dyrestudier er imidlertid tidkrevende og kostbar. Det er også tiltak for å redusere dyreforsøk. For eksempel har nå lovgivning (EC 1907/2006) i EU bestemmelser er ment å redusere dyreforsøk. Bestemmelsene er et krav at selskapene dele data for å unngå dyr testing og få godkjenning fra den europeiske kjemikalier Agency før du utfører foreslåtte tester på dyr. Under bestemmelsene i rekkevidde, bør dyr testing være en siste utvei. Det er også europeiske kosmetikk regulering (EC 1223/2009) som faset ut testing av kosmetikk i dyr. Når dyrestudier er utført, de guidet av prinsippene i 3Rs (raffinement, reduksjon og erstatning), som gir et rammeverk for mer Human dyr forsket, redusere antall dyr som brukes, og bruke ikke-dyr alternativer der det er mulig. For disse grunner, har feltet toksikologi søkt å vedta i vitro analyser som kan gi innsikt i molekylære mekanismer toksisitet og kan gjøres i høyere gjennomstrømming⁴. Dette er en funksjonell toksikologi tilnærming der giftstoffer defineres av sin funksjon, og ikke av deres kjemi. Tatt et steg videre, funksjonelle toxicogenomics søker å forstå roller bestemt genene spiller i effekten av giftstoffer⁵. Med anvendelse av siRNA teknologi, kan skjermer å undersøke gen funksjon i giftstoffer molekylære og mobilnettet svar gjøres på høy gjennomstrømning. siRNA er dobbel strandet RNA molekyler som er 19-25 nukleotider lang som Utnytt innlegget transcriptional gene stanse veien i alle pattedyrceller⁶. Disse syntetisk laget og designet for å målrette et bestemt gen. Når introdusert i en celle, siRNA er behandlet og en tråd, guide Peasmarsh, lastes inn RNA-indusert stanse komplekset (RISC). SiRNA leder RISC til en supplerende region i en mRNA molekyl, og RISC forringer mRNA. Dette resulterer i reduksjon av uttrykk for bestemte genet. Den resulterende reduksjonen av uttrykk for bestemte genet kan deretter studeres i toxicant eksponert cellene for å fastslå funksjonen av det genet i cellulær respons til toxicant. En slik tilnærming er brukt til videre forstå mekanismer for Risin mottakelighet og AHR-avhengige induksjon av CYP1A1^7,8.

Listen kjemiske terrorisme risiko vurdering (CTRA) og giftige industrikjemikalier (TIC) oppføringene har spesifiserte Velg kjemikalier basert på toksisitet og potensial til å bli utgitt under en terrorist, krigføring eller industrielle ulykke hendelsen⁹. Vi søker en siRNA høy gjennomstrømning screening (HTS) toxicogenomic tilnærming til studiet av CTRA listen giftstoffer, er definert til å være høy risiko for bruk i en terrorist hendelsen. Tradisjonelle toksikologi søker å forstå de negative effektene som kjemikalier har på levende organismer; men vi har en ytterligere ønske om å forstå mekanismene for skade for å informere utviklingen av legemiddelselskap og terapeutiske metoder, og muligens oppdage molekyler som kan målrettes for terapeutisk utvikling. Dette arbeidet på noen måter kan anses tilsvarende bruk av høy gjennomstrømning siRNA screening og cellen basert analyser i stoffet funnet prosess¹⁰. En stor forskjell vil være at stoffet funnet vanligvis søker et entall mål for terapeutisk funnet mens i vår tilnærming er det noe usannsynlig at det skulle være et entall mål med høy terapeutisk verdi for behandling av toxicant eksponering. Vi forventer at en effektiv behandling paradigme for toxicant eksponering ville kreve en mangesidig tilnærming til å oppnå høy terapeutisk verdi og toxicogenomic data kan livsviktig informere en effektiv behandling paradigme.

Borstemmaskin automatisering gir høy gjennomstrømning metodikk laboratorier utenfor farmasøytisk eller bioteknologi industrien. I vitro studier ved våre institute har historisk vært tradisjonelle analyser som er lav overføringshastighet^11,12,13. I de siste årene, har vårt laboratorium overført til bruk av Borstemmaskin robotikk utføre høy gjennomstrømning siRNA screening. Her presenterer vi avgrensningen av okulære celle modeller og utviklingen av in vitro eksponering metoder for fluor (HF) og chloropicrin (CP) egnet for høy gjennomstrømning siRNA screening. Vårt mål er å identifisere molekyler som regulerer cellular skade svar på disse giftstoffer. Målene for siRNA biblioteket vi valgte inkluderer G protein-kombinert reseptorer, protein kinaser, proteaser, phosphatases, ionekanaler og andre potensielt druggable mål. HF og CP ble valgt for studier av kryssreferanser CTRA listen agenter med ToxNet rapporter av industriulykker å finne de som presenterer den største risikoen for okulær skade via damp eksponering^9,14. CP (kjemisk formel Cl₃CNO₂, CAS-nr 76-06-2) ble opprinnelig brukt som et tåregass i WWI¹⁵. Det brukes nå som et landbruket fumigant og funksjoner en nematicide soppdreper og insektmiddel¹⁶. Fluor (HF) brukes i prosesser inkludert alkylation oljeraffinerier og elektrokjemisk fluorination organiske forbindelser¹⁷. HF (kjemisk formel HF, CAS-nr 62778-11-4) er en gass men i vandig form flussyre (HFA, CAS nummer 7664-39-3). Derfor vi valgt å bruke HFA i våre i celle eksponering modeller. SV40 store T antigen udødeliggjort menneskelig hornhinnen epithelial celle linje SV40-HCEC ble valgt for studien. Cellen levedyktighet og provoserende markøren IL-8 ble valgt som endepunkter fordi mål som er involvert i cellular skade bør gjenspeiles i celledød og betennelsesreaksjon. Spesielt hvis mål spiller en beskyttende rolle toxicant eksponering, bør celledød og/eller inflammatoriske cytokiner produksjonen øke når Måluttrykket er hemmet av siRNA. Motsatt ville være sant for mål som spiller en negativ rolle. Kronisk betennelse vises også, å spille en rolle i hornhinnen patologi etter eksponering og intervensjon i celle død trasé kan forbedre kliniske utfallet^2,18.

Protocol

1. celle kultur vedlikehold Vokse celle linjen SV40-HCEC på 37 ° C, 5% CO2og 90% fuktighet i DMEM F-12 med 15% fosterets bovin serum (FBS), 1% L-glutamin, 10 µg/L til epidermal vekstfaktor (EGF) og 5 mg/L insulin. Passasje celle linjen hver 3-4 dager (avhengig av seeding tetthet) for å sikre at confluency aldri overstiger 80% under kultur vedlikehold. Koble cellene fra kolber bruker avdeling løsning (14 mL løsning for hver 150 cm2 kolbe) og inkubasjon på 37 ° C …

Representative Results

Eksponering metodeutvikling Vi finjusterte og evalueres hensiktsmessigheten av menneskelig hornhinnen tarmepitelet linjen SV40-HCEC for bruk i HTS studier. SV40-HCEC ble udødeliggjort med SV-40 store T antigen og var en gave fra Dhanajay Pal23. Det var for mange variabler utforsket i eksponering metodikk utvikling å presentere presist her, og så bare noen eksempler på resultatene som …

Discussion

Her beskriver vi våre metoder og resultater på utviklingen av en høy gjennomstrømning hornhinnen epithelial celle screening modell for studiet av HF og CP skader. Vi har også presentere resultatene fra primær siRNA skjermen for HF skade. Det var mange utfordringer til utviklingen av HTS modeller for studiet av TIC skader. Metoder som vi finner i litteraturen knyttet til studiet av HF, HFA eller CP i celle kultur modeller var av liten hjelp. De fleste i vitro studier på fluor ion involverer oral celler og …

Materials

Bravo liquid handing platform	Agilent or equivalent	G5409A
Bravo plate shaker	Agilent or equivalent	Option 159
Bravo 96LT disposable tip head	Agilent or equivalent	Option 178	96-channel large tip pipetting head unit
Bravo 96ST disposable tip head	Agilent or equivalent	Option 177	96-channel small tip pipetting head unit
Bravo 384ST disposable tip head	Agilent or equivalent	Option 179	384-channel small tip pipetting head unit
Bravo 96 250 μL sterile barrier tips	Agilent or equivalent	19477-022
Bravo 384 30 μL sterile barrier tips	Agilent or equivalent	19133-212
Bravo 384 70 μL sterile barrier tips	Agilent or equivalent	19133-212
EnSpire multimode plate reader	Perkin Elmer or equivalent	2300-0000	AlphaLISA assay detector with high power laser excitation
IL-8 (human) AlphaLISA Detection Kit	Perkin Elmer or equivalent	AL224F	no-wash bead-based assay
ProxiPlate-384 Plus white 384-shallow well microplates	Perkin Elmer or equivalent	6008359
Lipofectamine RNAiMAX	Invitrogen or equivalent	13778500	Transfection reagent
Opti-MEM 1 Reduced Serum Medium	Invitrogen or equivalent	31985070
TrypLE Express	Gibco or equivalent	12605010	Cell detachment solution
IncuCyte Zoom	Essen Instruments or equivalent	ESSEN BIOSCI 4473	Incubator-housed automated microscope
Chloropicrin	Trinity Manufacturing or equivalent	N/A	Acute toxicity and irritant
DMEM-F12 cell culture medium	Invitrogen or equivalent	11330-057	Contains HEPES
Fetal bovine serum	Invitrogen or equivalent	1891471
Human epidermal growth factor (cell culture grade)	Invitrogen or equivalent	E9644-.2MG
Recombinant human insulin (cell culture grade)	Invitrogen or equivalent	12585-014
Penicillin-Streptomycin solution (cell culture grade)	Invitrogen or equivalent	15140122
Hydrocortisone (cell culture grade)	Sigma or equivalent	H0888-10G
Glucose  (cell culture grade)	Sigma or equivalent	G7021
PBS  (cell culture grade)	Sigma or equivalent	P5493
siRNA	Dharmacon or equivalent	various
Thiazolyl blue tetrazolium bromide	Sigma or equivalent	M5655	MTT assay substrate
siRNA buffer	Thermo or equivalent	B002000
96-well cell culture plates	Corning or equivalent	CLS3595
T150 cell culture flasks	Corning or equivalent	CLS430825
BSL-2 cell culture hood	Nuaire or equivalent	NU-540
300 mL robotic reservoirs	Thermo or equivalent	12-565-572
96 baffled automation reservoirs	Thermo or equivalent	1064-15-8
500 mL sterile disposable storage bottles	Corning or equivalent	CLS430282
Microplate heat sealer	Thermo or equivalent	AB-1443A
Microplate heat sealing foil	Thermo or equivalent	AB-0475
Cardamonin	Tocris or equivalent	2509	Anti-inflammatory, used as positive control
SKF 86002	Tocris or equivalent	2008	Anti-inflammatory, used as positive control
DMSO	Sigma or equivalent	D8418
48% hydrofluoric acid	Sigma or equivalent	339261	Corrosive and acute toxicity
1000 μL Single channel pipettors	Rainin or equivalent	17014382
200 μL Single channel pipettors	Rainin or equivalent	17014391
20 μL Single channel pipettors	Rainin or equivalent	17014392
1000 μL 12-channel pipettors	Rainin or equivalent	17014497
200 μL 12-channel pipettors	Rainin or equivalent	17013810
20 μL 12-channel pipettors	Rainin or equivalent	17013808
Pipettor tips 1000 μL	Rainin or equivalent	17002920
Pipettor tips 200 μL	Rainin or equivalent	17014294
Pipettor tips 20 μL	Rainin or equivalent	17002928
Chemical fume hood	Jamestown Metal Products	MHCO_229
384-well sample storage plates	Thermo or equivalent	262261
Sodium chloride	Sigma or equivalent	S6191
50 mL conical tubes	Thermo or equivalent	14-959-49A
Serological pipettes 50 mL	Corning or equivalent	07-200-576
Serological pipettes 25 mL	Corning or equivalent	07-200-575
Serological pipettes 10 mL	Corning or equivalent	07-200-574
Serological pipettes 5 mL	Corning or equivalent	07-200-573
SV40-HCEC immortalized human corneal epithelial cells	N/A	N/A	These cells are not commercially available, but can be obtained from the investigators cited in the article
Sceptor Handheld Automated Cell Counter	Millipore or equivalent	PHCC20060
GeneTitan Multi-Channel (MC) Instrument	Affymetrix or equivalent	00-0372
Affymetrix 24- and 96-array plates	Affymetrix or equivalent	901257; 901434
Draegger tube HF	Draeger or equivalent	8103251
Draegger tube CP	Draeger or equivalent	8103421
Draegger pump	Draeger or equivalent	6400000
Clear Plate seals	Resesarch Products International or Equivalent	202502
Reagent reservoirs	VistaLab Technologies or equivalent	3054-1000
Xlfit	IDBS or equivalent	N/A	Excel add-in used for automated curve fitting