用光片荧光显微镜观察运动轴突导航和小鼠胚轴突树枝状的定量化
Summary
在这里, 我们描述了一个协议, 以可视化的运动神经元投射和轴突树枝状在转基因 Hb9::GFP 小鼠胚胎. 在对运动神经元进行染色后, 我们用光片荧光显微镜对图像胚胎进行了定量分析。本协议适用于中枢神经系统的其它神经元导航过程。
Abstract
脊髓运动神经元 (MNs) 扩展其轴突, 以与其支配目标进行沟通, 从而控制脊椎动物的运动和复杂任务。因此, 在发育和变性过程中, 揭示运动神经轴突如何定位、arborize 和支配其周围肌肉靶点的分子机制至关重要。尽管转基因的Hb9::GFP鼠标线长期用于可视化胚胎发育过程中的马达轴突轨迹, 但由于模式复杂, 对轴突终端树枝状的详细描述仍然不完整,目前光学显微镜的局限性。在这里, 我们描述了一个改进的协议, 结合光片荧光显微镜 (LSFM) 和稳健的图像分析, 定性和定量可视化发展电机轴突。该系统可以很容易地用于交叉遗传突变体或锰疾病模型与Hb9::GFP线, 揭示了新的分子机制, 导致缺陷的电机轴突导航和树枝状。
Introduction
脊髓的 MNs 是中枢神经系统的一部分, 但支配周围的肌肉来控制运动。在发育中的脊髓中, 根据脊索和相邻胚胎背部发出的信号建立锰祖细胞 (pMNs)。所有分化后有丝分裂后的 MNs, 然后产生从 pMNs, 最终产生一系列锰亚型沿 rostrocaudal 轴的脊髓1,2。脊髓的地形和解剖良好组织。它们的形态学排列与各自目标在外围3中的位置相关。在达到他们的肌肉目标, 轴突接收细胞和外源性神经营养因子, 促使他们扩大和分支进一步进入肌肉。神经支配和分支缺陷可能导致无法形成肌电结 (NMJ)。例如, 神经胶质源性神经营养因子 (GDNF) 诱发的 Pea3 是必不可少的轴突树枝状到皮肤阔肌 (CM) 和后背筋 (LD) 肌肉 4, 5.此外,进餐挖空小鼠胚胎显示膈神经有缺陷的树枝状在隔膜, 导致呼吸衰竭和死亡后立即出生 6, 7.因此, 这最后一步的锰成熟 (即, 轴突投射和分支) 是至关重要的, 以确保神经元之间的沟通和目标细胞。
为了查看树枝状模式, 研究人员通常进行共焦成像或双光子荧光显微镜的切片或全挂载样本 8, 9, 10.这两种显微技术都能产生可接受的分辨率和深度穿透力。双光子荧光光镜涉及显影的激发, 同时吸收两个低能光子11。由于双光子激励使用近红外辐射, 减少的激发频率有助于减少散射和更好的组织穿透多达1毫米的组织, 从而使成像更深入。共焦显微镜通过过滤出焦点信号并在焦点平面12中收集光来消除。通过这种方法, 可以将来自不同焦平面的样本图像组合起来, 通过 Z 堆栈函数生成三维 (3D) 图像。然而, 由于大部分光线被堵塞, 而且高数值孔径掩盖了景深, 信号强度降低。更重要的是, 这两种技术都有助于严重的光损伤和毒性, 因为整个标本接受照明, 即使只有一架飞机是在给定的时间成像。
为了规避这些缺点, LSFM 已成为一种受青睐的替代方案, 具有快速、高效、光毒性13、14等优点.此外, LSFM 还允许多视图成像。这种方法特别适合于可视化电机轴突及其分散终端, 因为它们分布在3D 空间。LSFM 优于其他两个选项, 因为示例安装在允许围绕垂直轴旋转和沿 x、y 和 z 轴移动的舞台上。这种设置不仅允许对样本进行最小的屏蔽, 而且还可以选择理想的光照路径、双光子和共焦显微镜的缺点, 这两种方法都需要在平面滑动上安装样品。因此, LSFM 是最合适的工具, 3D 成像的轴突树枝状和量化的运动神经终端的小鼠胚胎。
Protocol
Representative Results
Discussion
在某些情况下, 议定书中的若干步骤可能会受到变化。例如, 固定时间取决于胚胎的年龄, 从2小时到1天或更多的时候使用新鲜的多聚甲醛。由于固定是在整个染色之前进行的, 对于蛋白质交联敏感的抗体, 甲醇可以用作替代的固液剂。对于染色时的高信噪比, 必须优化洗涤剂浓度 (0.1-0.5%)。抗体孵化前后的额外洗涤步骤也可以增加信噪比。此外, 组织清除步骤对于确保在整个深轴突投影中的光路畅通?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
LSFM 实验和数据分析部分采用先进的光学显微镜, 在中央研究院仪器服务部门, 并在舒沈女士的协助下进行。我们感谢 IMB 的成像核心设施, Imaris 图像分析的大量技术援助苏女士。IMB 的科学英语编辑核心审查了手稿。这项工作由中央研究院职业发展奖 (CDA-107-L05)、多数 (104-2311-001-030-MY3) 和人权机构 (NHRI-EX106-10315NC) 资助。
Materials
| Hb9::GFP | The Jackson labortory | 005029 | Collect embryos of embryonic day 13.5 (E13.5) |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | For 200ml: Add 20ml 10X PBS, 8g PFA in ddH2O. Adjust pH to 7.4 with NaOH (10N). Filter sterilize and store at -20 °C. | ||
| Phosphate buffer saline 10X (PBS 10X) | For 1L: Add 80 g NaCl, 2 g KCl,14.4g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4 and top up with ddH2O. Autoclave and store at RT. | ||
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 26140079 | |
| Sheep polyclonal anti-GFP | AbD Serotec | 4745-1051 | 1:1000 |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep | Invitrogen | A-11015 | 1:1000 |
| RapiClear 1.47 clearing reagent | SunJin Lab | RC147001 | |
| 1.5ml micro tube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 24 wells plate | ThermoFisher | 142475 | |
| 5 SA Tweezer | ideal-tek | 3480641 | |
| Iris Scissors striaght sharp/sharp | Aesculap | BC110R | |
| Microsurgery Scalpels, single use | Aesculap | BA365 | |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ800 | |
| Shaker | TKS | RS-01 | |
| Lightsheet Z.1 microscope | Carl Zeiss Microscopy | ||
| Imaris 8.4.0 image analysis software | Bitplane, Zurich, Switzerland | ||
| B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J (Hb9::GFP mice) | The Jackson Laboratory | 005029 |
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