ויזואליזציה של האקסון מנוע והניווט כימות של האקסון Arborization של העוברים העכבר באמצעות מיקרוסקופ אור גיליון קרינה פלואורסצנטית
Summary
כאן, אנו מתארים את פרוטוקול להמחשת הקרנה מוטור נוירון, האקסון arborization ב הטרנסגניים Hb9::GFP העכבר עוברי. לאחר immunostaining עבור מוטורי לגלוקוז, השתמשנו גיליון אור זריחה מיקרוסקופ כדי התמונה עוברי עבור ניתוח כמותי עוקבות. פרוטוקול זה חל תהליכים ניווט אחרים תא עצב במערכת העצבים המרכזית.
Abstract
בעמוד השדרה מוטורי לגלוקוז (MNs) להרחיב את האקסונים שלהם לתקשר עם המטרות innervating שלהם, ובכך שליטה התנועה ועל משימות מורכבות גולגולת. לפיכך, חיוני לחשוף את המנגנונים המולקולריים של איך מנוע אקסונים לנווט, arborize ו innervate השרירים ההיקפיים שלהם מטרות במהלך התפתחות והתנוונות. למרות הטרנסגניים קווים העכבר Hb9::GFP שירתו זמן לדמיין מסלולים מוטוריים האקסון במהלך התפתחות עובריים, תיאורים מפורטים של הקשת של האקסון arborization מסוף להישאר שלם בשל המורכבות דפוס ו מגבלות של מיקרוסקופ אופטי הנוכחי. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול משופרת המשלבת אור גיליון פלורסצנטיות מיקרוסקופ (LSFM) וניתוח תמונות איכותית, באופן כמותי להמחיש פיתוח אקסונים מוטוריים. מערכת זו יכולים לאמץ בקלות לעבור מוטציות גנטיות או MN מודלים מחלה עם קווים Hb9::GFP , חשיפת המנגנונים המולקולריים הרומן להוביל לפגמים האקסון מנוע ניווט ו- arborization.
Introduction
MNs בעמוד השדרה הם החלק של מערכת העצבים המרכזית אך innervate השרירים ההיקפיים בקרת תנועה. בחוט השדרה המתפתח, MN אבות (pMNs) נקבעו על פי האותות שמקורם מיתר הגב של somites הסמוך. כל הבדיל MNs mitotic שלאחר מכן מופקים מן pMNs, בסופו של דבר והוליד סדרה של MN יחוברו לאורך ציר rostrocaudal של חוט השדרה1,2. MNs בעמוד השדרה מאורגנים טופוגרפית, גם מבחינה אנטומית. הסידור שלהם מורפולוגי בקורלציה עם המיקום החדש של יעד בהתאמה שלהם של הפריפריה3. כשמגיעים ממטרותיהם שריר, אקסונים לקבל גורמים neurotrophic הסלולר ואת אקסוגני לגרום להם להרחיב, סניף נוסף לתוך השרירים. העצבוב של פגמים מסעף עשוי לתרום הכשל כדי ליצור צמתי neuromuscular (NMJ). לדוגמה, גליה, נגזר neurotrophic גורמים (GDNF)-Pea3 המושרה היא הכרחית עבור אקסון arborization אל תוך עורית מקסימוס (ס מ), שרירי הגב הרחיב (LD)4,5. בנוסף, דיין נוקאאוט העכבר עוברי מראים arborization פגומים של עצבים הסרעפת הסרעפת, גורם לכשל נשימתי ותמותה מיד לאחר הלידה6,7. לכן, זה הצעד האחרון של התבגרות MN (קרי, הקרנה עצב ומסעף) היא קריטית כדי להבטיח תקשורת בין נוירונים ותאי המטרה.
כדי להציג דפוסים arborization, חוקרים התנהגות בדרך כלל קונאפוקלית לדימות או מיקרוסקופ אור שני הפוטונים זריחה של דגימות משרטוטי או כולה-הר8,9,10. שתי טכניקות מיקרוסקופית אלו יוצרות מקובל הרזולוציה ועומק חדירה. מיקרוסקופ אור שני הפוטונים פלורסצנטיות כרוך עירור של fluorophores על ידי סימולטני קליטת פוטונים נמוכה יותר של אנרגיה שני11. מאז שני הפוטונים עירור משתמשת קרינה אינפרא אדום, התדר ירד עירור תורמת פיזור מופחתת, חדירה יותר רקמות עד 1 מ מ בתוך הרקמה, ובכך מאפשר הדמיה עם עומק גדול. מיקרוסקופיה קונפוקלית מסירה על-ידי מסנני out-of-להתמקד מאותת ולא רק אוסף אור בתוך מטוס מוקד12. עם גישה זו, ניתן לשלב תמונות של דגימות מטוסים מוקד שונים כדי לייצר תמונת תלת מימד (3D) באמצעות פונקציה Z-מחסנית. עם זאת, עוצמת האות פוחת כמו רוב האור נחסם ולאחר פתחים מספרית גבוהה מטשטשים את העומק השדה. חשוב מכך, בשתי הטכניקות לתרום נזקי חמור ואת phototoxicity מאז הדגימה כל מקבל תאורה גם כאשר המטוס היחיד הוא עם תמונה בזמן נתון.
כדי לעקוף חסרונות אלה, LSFM הפך חלופה המועדף, עם היתרונות של להיות מהיר, אור-יעיל, פחות פוטוטוקסי13,14. בנוסף, LSFM מאפשר הדמיה multi-view. גישה זו מתאימה במיוחד כדי להמחיש אקסונים מוטוריים ומסופי לפיזור שלהם כפי הם התפשטו בחלל תלת-ממד. LSFM outperforms שתי האפשרויות האחרות כי דגימות הם רכובים על במה המאפשרת סיבוב סביב ציר אנכי ותנועות לאורך x, y ו- z. זה לא רק מאפשר תצוגה חסומים מינימלית של המדגם, אלא גם הבחירה של נתיב רצויה תאורה, חסרונה של מיקרוסקופ שני הפוטונים, וידאו, אשר שניהם דורשים הרכבה של דגימות בשקופית שטוח. לכן, LSFM הוא הכלי המתאים ביותר עבור הדמיה תלת-ממדית של האקסון arborization, כימות של עצבים מוטוריים המסופים העכבר עוברי.
Protocol
Representative Results
Discussion
מספר צעדים בפרוטוקול עלולים להיות נתונים לשינויים בנסיבות מסוימות. לדוגמה, משך הזמן של קיבעון תלוי גיל העוברים, משתנה מ- 2 h ימים 1 או יותר באמצעות paraformaldehyde טריים. מאז קיבוע מבוצע לפני כל הר immunostaining, עבור נוגדנים הרגישים crosslinking חלבון, מתנול יכול לשמש כסוכן מקבע חלופי. עבור יחס אות לרעש גבוה עם…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
LSFM ניסויים וניתוח נתונים בוצעו באופן חלקי באמצעות מיקרוסקופים אופטיים מתקדמים של חלוקה של כלי השירות Sinica אקדמיה, בסיועם של גברת שו-חן שן. אנו מודים גב’ סו-פינג לי מהספינה הדמיה הליבה מתקן של IMB לסיוע טכני ניכר עם ניתוח תמונות Imaris. הליבה של IMB המדעית עריכה עברית סקרו את כתב היד. עבודה זו ממומן על ידי האקדמיה Sinica הקריירה פיתוח פרס (CDA-107-L05) ביותר (104-2311-B-001-030-MY3), NHRI (NHRI-EX106-10315NC).
Materials
| Hb9::GFP | The Jackson labortory | 005029 | Collect embryos of embryonic day 13.5 (E13.5) |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | For 200ml: Add 20ml 10X PBS, 8g PFA in ddH2O. Adjust pH to 7.4 with NaOH (10N). Filter sterilize and store at -20 °C. | ||
| Phosphate buffer saline 10X (PBS 10X) | For 1L: Add 80 g NaCl, 2 g KCl,14.4g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4 and top up with ddH2O. Autoclave and store at RT. | ||
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 26140079 | |
| Sheep polyclonal anti-GFP | AbD Serotec | 4745-1051 | 1:1000 |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep | Invitrogen | A-11015 | 1:1000 |
| RapiClear 1.47 clearing reagent | SunJin Lab | RC147001 | |
| 1.5ml micro tube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 24 wells plate | ThermoFisher | 142475 | |
| 5 SA Tweezer | ideal-tek | 3480641 | |
| Iris Scissors striaght sharp/sharp | Aesculap | BC110R | |
| Microsurgery Scalpels, single use | Aesculap | BA365 | |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ800 | |
| Shaker | TKS | RS-01 | |
| Lightsheet Z.1 microscope | Carl Zeiss Microscopy | ||
| Imaris 8.4.0 image analysis software | Bitplane, Zurich, Switzerland | ||
| B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J (Hb9::GFP mice) | The Jackson Laboratory | 005029 |
References
- Davis-Dusenbery, B. N., Williams, L. A., Klim, J. R., Eggan, K. How to make spinal motor neurons. Development. 141, 491-501 (2014).
- Stifani, N. Motor neurons and the generation of spinal motor neuron diversity. Front Cell Neurosci. 8, 293 (2014).
- Kania, A., Jessell, T. M. Topographic motor projections in the limb imposed by LIM homeodomain protein regulation of ephrin-A:EphA interactions. Neuron. 38, 581-596 (2003).
- Livet, J., et al. ETS gene Pea3 controls the central position and terminal arborization of specific motor neuron pools. Neuron. 35, 877-892 (2002).
- Kanning, K. C., Kaplan, A., Henderson, C. E. Motor neuron diversity in development and disease. Annu Rev Neurosci. 33, 409-440 (2010).
- Matsumoto, S., Kiryu-Seo, S., Kiyama, H. Motor Nerve Arborization Requires Proteolytic Domain of Damage-Induced Neuronal Endopeptidase (DINE) during Development. J Neurosci. 36, 4744-4757 (2016).
- Nagata, K., et al. ECEL1 mutation implicates impaired axonal arborization of motor nerves in the pathogenesis of distal arthrogryposis. Acta Neuropathol. 132, 111-126 (2016).
- Catela, C., Shin, M. M., Lee, D. H., Liu, J. P., Dasen, J. S. Hox Proteins Coordinate Motor Neuron Differentiation and Connectivity Programs through Ret/Gfralpha Genes. Cell Rep. 14, 1901-1915 (2016).
- Bonanomi, D., et al. Ret is a multifunctional coreceptor that integrates diffusible- and contact-axon guidance signals. Cell. 148, 568-582 (2012).
- Tung, Y. T., et al. Mir-17 approximately 92 Governs Motor Neuron Subtype Survival by Mediating Nuclear PTEN. Cell Rep. 11, 1305-1318 (2015).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Jonkman, J., Brown, C. M. Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques. J Biomol Tech. 26, 54-65 (2015).
- Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nat Methods. 12, 30-34 (2015).
- Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. J Histochem Cytochem. 59, 129-138 (2011).
- Hanley, O., et al. Parallel Pbx-Dependent Pathways Govern the Coalescence and Fate of Motor Columns. Neuron. 91, 1005-1020 (2016).
- De Marco Garcia, N. V., Jessell, T. M. Early motor neuron pool identity and muscle nerve trajectory defined by postmitotic restrictions in Nkx6.1 activity. Neuron. 57, 217-231 (2008).
- Li, C. J., et al. MicroRNA filters Hox temporal transcription noise to confer boundary formation in the spinal cord. Nat Commun. 8, 14685 (2017).
- Swoger, J., Pampaloni, F., Stelzer, E. H. Light-sheet-based fluorescence microscopy for three-dimensional imaging of biological samples. Cold Spring Harb Protoc. 2014, 1-8 (2014).
- Pantazis, P., Supatto, W. Advances in whole-embryo imaging: a quantitative transition is underway. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 327-339 (2014).
- Reynaud, E. G., Tomancak, P. Meeting report: first light sheet based fluorescence microscopy workshop. Biotechnol J. 5, 798-804 (2010).
