Visualisation de l’axone moteur Navigation et la Quantification de ces axones dans des embryons de souris à l’aide de la microscopie de Fluorescence nappe de lumière
Summary
Nous décrivons ici un protocole pour la visualisation de projection des motoneurones et arborisation axone dans des embryons de souris transgéniques Hb9::GFP . Après immunostaining des neurones moteurs, nous avons utilisé la microscopie de fluorescence nappe de lumière aux embryons d’image analyse quantitative. Le présent Protocole s’applique à d’autres processus de navigation neurone du système nerveux central.
Abstract
Les neurones moteurs spinaux (MNs) étendent leurs axones pour communiquer avec leurs cibles innervating, contrôlant ainsi le mouvement et les tâches complexes chez les vertébrés. Ainsi, il est essentiel de découvrir les mécanismes moléculaires de comment moteur axones Placez-vous, arborize et innervent leur musculature périphérique cible pendant le développement et la dégénérescence. Bien que les lignées de souris transgéniques Hb9::GFP ont longtemps servi de visualiser les trajectoires de l’axone moteur durant le développement embryonnaire, des descriptions détaillées de l’ensemble de l’arborisation terminale axon restent incomplets en raison de la complexité du modèle et limitations de la microscopie optique actuelle. Nous décrivons ici un protocole amélioré qui combine la microscopie de fluorescence de nappe de lumière (LSFM) et analyse d’images robuste qualitativement et quantitativement visualiser des axones moteurs de développement. Ce système peut être facilement adopté pour traverser mutants génétiques ou des modèles de maladies MN avec des lignes Hb9::GFP , révélant de nouveaux mécanismes moléculaires qui conduisent à des irrégularités dans la navigation de l’axone moteur et arborisation.
Introduction
MNs de la colonne vertébrale sont la partie du système nerveux central mais innervent des muscles périphériques pour contrôler le mouvement. Dans la pays en développement de la moelle épinière, progéniteurs MN (PMN) sont établis selon les signaux émanant de la notochorde et des somites adjacents. Toutes différencient MNs post-mitotiques sont ensuite générés à partir de PMN, éventuellement donnant lieu à une série de sous-types de MN le long de l’axe Rostro de la moelle épinière1,2. La colonne vertébrale MNs sont topographiquement et anatomiquement bien organisés. Leur arrangement morphologique est en corrélation avec la position de leurs cibles respectives dans la périphérie de3. En atteignant leurs objectifs de muscle, axones recevoir des facteurs neurotrophiques cellulaires et exogènes que les inciter à s’étendre et de la branche plus loin dans les muscles. Innervation et défauts ramifications peuvent contribuer à l’échec pour former des jonctions neuromusculaires (NMJ). Par exemple, des facteurs neurotrophiques gliales (GDNF)-Pea3 induite est indispensable pour ces axones dans maximus cutanée (CM) et4,5les muscles grand dorsal (LD). En outre, des embryons de souris knock-out DINE montrent défectueuse arborisation des nerfs phréniques dans le diaphragme, provoquant la mortalité et une insuffisance respiratoire immédiatement après la naissance de6,7. Cette dernière étape de maturation de MN (c.-à-d., projection axonale et ramification) est donc essentielle pour assurer la communication entre les neurones et les cellules cibles.
Pour afficher les modèles de l’arborisation, chercheurs procéder normalement à imagerie confocale ou microscopie de fluorescence biphotonique sectionnés ou entier-montent des échantillons8,9,10. Deux de ces techniques de microscopie génèrent acceptable résolution et profondeur de pénétration. Microscopie de fluorescence biphotonique implique l’excitation des fluorophores par absorption simultanée de deux photons de faible énergie,11. Puisque l’excitation biphotonique utilise le rayonnement infrarouge, la fréquence d’excitation baisse contribue à la diffusion réduite et meilleure pénétration tissulaire jusqu’à 1 mm dans les tissus, permettant ainsi l’imagerie avec une plus grande profondeur. Microscopie confocale supprime par les filtres de signaux de l’out-of-focus et recueille uniquement la lumière dans le plan focal12. Avec cette approche, images des échantillons provenant des plans focaux différents peuvent être combinés pour produire une image tridimensionnelle de (3D) via une fonction de Z-pile. Néanmoins, intensité du signal est réduite car la plupart de la lumière est bloquée et les ouvertures numériques hautes obscurcir la profondeur de champ. Plus important encore, les deux techniques contribuent au photovieillissement sévère et phototoxicité puisque l’échantillon entier reçoit illumination même lorsque qu’un avion est imagé à un moment donné.
Pour contourner ces lacunes, LSFM est devenu une alternative favorisée, avec l’avantage d’être rapide et efficace à la lumière et les moins phototoxique13,14. En outre, LSFM permet l’imagerie multi-vues. Cette approche est particulièrement adaptée à la visualisation des axones moteurs et leurs terminaux de dispersion comme ils se propagent dans l’espace 3D. LSFM surpasse les deux autres options parce que les échantillons sont montés sur une scène qui permet la rotation autour d’un axe vertical et les mouvements le long des x, y et les axes z. Cette configuration permet non seulement pour une vue bloqué au minimum de l’échantillon, mais aussi le choix d’un chemin de l’illumination souhaitable, une lacune de la microscopie biphotonique et confocale, qui nécessitent le montage d’échantillons sur une lame plate. LSFM est donc l’outil plus approprié pour l’imagerie 3D d’arborisation axon et pour la quantification des terminaisons nerveuses moteur dans des embryons de souris.
Protocol
Representative Results
Discussion
Plusieurs étapes dans le protocole peuvent être soumis à des changements dans certaines circonstances. Par exemple, la durée de fixation varie selon l’âge des embryons, variant de 2 h à 1 ou plusieurs jours à l’aide de paraformaldéhyde fraîchement faites. Étant donné que la fixation est effectuée avant toute monture immunomarquage, des anticorps qui sont sensibles aux protéines de réticulation, méthanol peut servir un autre agent fixateur. Pour un rapport signal sur bruit élevé sur la coloration, il …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
LSFM expériences et analyse des données ont été réalisées en partie en utilisant les microscopes optiques avancés de la Division du Service de l’Instrument à l’Academia Sinica et avec l’aide de Mme Shen Shu-Chen. Nous remercions Mme Sue-Ping Lee de l’Imaging Core Facility de IMB pour une assistance technique considérable avec l’analyse d’image Imaris. Scientifique anglais édition Core les microbilles ont examiné le manuscrit. Ce travail est financé par l’Academia Sinica Career Development Award (CDA-107-L05), plus (104-2311-B-001-030-MY3) et INDH (INRH-EX106-10315NC).
Materials
| Hb9::GFP | The Jackson labortory | 005029 | Collect embryos of embryonic day 13.5 (E13.5) |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | For 200ml: Add 20ml 10X PBS, 8g PFA in ddH2O. Adjust pH to 7.4 with NaOH (10N). Filter sterilize and store at -20 °C. | ||
| Phosphate buffer saline 10X (PBS 10X) | For 1L: Add 80 g NaCl, 2 g KCl,14.4g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4 and top up with ddH2O. Autoclave and store at RT. | ||
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 26140079 | |
| Sheep polyclonal anti-GFP | AbD Serotec | 4745-1051 | 1:1000 |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep | Invitrogen | A-11015 | 1:1000 |
| RapiClear 1.47 clearing reagent | SunJin Lab | RC147001 | |
| 1.5ml micro tube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 24 wells plate | ThermoFisher | 142475 | |
| 5 SA Tweezer | ideal-tek | 3480641 | |
| Iris Scissors striaght sharp/sharp | Aesculap | BC110R | |
| Microsurgery Scalpels, single use | Aesculap | BA365 | |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ800 | |
| Shaker | TKS | RS-01 | |
| Lightsheet Z.1 microscope | Carl Zeiss Microscopy | ||
| Imaris 8.4.0 image analysis software | Bitplane, Zurich, Switzerland | ||
| B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J (Hb9::GFP mice) | The Jackson Laboratory | 005029 |
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