Visualizzazione di navigazione motore Axon e quantificazione di Axon Arborization negli embrioni del Mouse utilizzando la microscopia a fluorescenza foglio leggero
Summary
Qui, descriviamo un protocollo per la visualizzazione di proiezione del neurone di motore e arborization assone in embrioni di topo transgenici Hb9::GFP . Dopo immunostaining per motoneuroni, abbiamo usato Microscopia di fluorescenza del foglio leggero agli embrioni di immagine per la successiva analisi quantitativa. Questo protocollo è applicabile ad altri processi di navigazione di neuroni nel sistema nervoso centrale.
Abstract
Motoneuroni spinali (MNs) estendere loro assoni di comunicare con i loro obiettivi innervating, controllando quindi il movimento e compiti complessi nei vertebrati. Quindi, è fondamentale per scoprire i meccanismi molecolari di quanto destinato a motore assoni spostarsi, Alzaia e innervano i muscoli periferici durante lo sviluppo e la degenerazione. Anche se linee transgeniche di mouse Hb9::GFP hanno servito a lungo per visualizzare traiettorie assone motore durante lo sviluppo embrionale, descrizioni dettagliate dello spettro completo di arborization terminale dell’assone rimangono incomplete a causa della complessità del modello e limitazioni di microscopia ottica attuale. Qui, descriviamo un protocollo migliorato che combina microscopia di fluorescenza foglio leggero (LSFM) e analisi di immagine robusta qualitativamente e quantitativamente visualizzare lo sviluppo di motore assoni. Questo sistema può essere facilmente adottato per attraversare mutanti genetici o modelli di malattia MN con linee Hb9::GFP , rivelando nuovi meccanismi molecolari che portano a difetti nella navigazione dell’assone motore e arborization.
Introduction
MNs spinale sono la parte del sistema nervoso centrale ma innervano i muscoli periferici per controllare il movimento. Nel midollo spinale in via di sviluppo, progenitori MN (pMNs) sono stabiliti secondo i segnali provenienti dalla notocorda e metameri adiacenti. Tutto differenziato post-mitotici MNs sono poi generati da pMNs, alla fine dando vita a una serie di sottotipi di MN lungo l’asse rostrocaudal del midollo spinale1,2. MNs spinale sono topograficamente e anatomicamente ben organizzato. Loro disposizione morfologica correla con la posizione della loro rispettiva destinazione in periferia3. Dopo aver raggiunto i loro obiettivi di muscolo, assoni riceveranno fattori neurotrofici esogeni e cellulari che inducono ad estendere e ramo ulteriore nei muscoli. Innervazione e ramificazioni difetti possono contribuire al fallimento per formare giunzioni neuromuscolari (NMJ). Ad esempio, fattori di neurotrophic glial-derivato (GDNF)-Pea3 indotto è indispensabile per arborization assone in cutaneo maximus (CM) e dorsi di latissimus (LD) muscoli4,5. Inoltre, embrioni di topo knockout DINE Visualizza arborization difettoso di nervi frenici nel diaframma, causando mortalità ed il guasto respiratorio subito dopo nascita6,7. Pertanto, quest’ultimo passaggio di maturazione MN (cioè, proiezione assonale e ramificazione) è fondamentale per garantire la comunicazione tra neuroni e cellule bersaglio.
Per visualizzare i modelli di arborization, ricercatori conducono normalmente imaging confocale o microscopia di fluorescenza del due-fotone di campioni sezionati o intero-monta8,9,10. Entrambe le tecniche di microscopia generare accettabile risoluzione e profondità di penetrazione. Microscopia di fluorescenza del due-fotone comporta eccitazione di fluorofori dall’assorbimento simultaneo di due fotoni di bassa energia11. Poiché due-fotone eccitazione utilizza radiazioni del vicino infrarosso, la frequenza di eccitazione in diminuzione contribuisce alla dispersione ridotta e migliore penetrazione del tessuto fino a 1 mm di tessuto, permettendo così la formazione immagine con una profondità maggiore. Microscopia confocale rimuove dai filtri l’out-of-focus segnali e raccoglie solo luce all’interno del piano focale12. Con questo approccio, immagini di campioni da diversi piani focali possono essere combinati per produrre un’immagine tridimensionale (3D) tramite una funzione di Z-stack. Tuttavia, l’intensità del segnale è ridotta come la maggior parte della luce viene bloccato e alte aperture numeriche oscurano la profondità di campo. Ancora più importante, entrambe le tecniche contribuiscono alla photodamage severo e fototossicità, dal momento che l’esemplare intero riceve illuminazione anche quando un solo aereo è immaginato in un dato momento.
Per ovviare a tali carenze, LSFM è diventata un’alternativa favorita, con il vantaggio di essere veloce, luce-efficiente e meno fototossico13,14. Inoltre, LSFM permette imaging multi-view. Questo approccio è particolarmente adatto alla visualizzazione di motore assoni e loro dispersione terminali come si diffondono attraverso lo spazio 3D. LSFM supera le altre due opzioni, perché i campioni sono montati su un palco che permette la rotazione intorno a un asse verticale e movimenti lungo x, y e z assi. Questo set-up non solo permette una vista minimamente bloccata del campione, ma anche la scelta di un percorso di illuminazione desiderabile, una lacuna del due-fotone e confocale microscopia, entrambi i quali richiedono il montaggio di campioni su una slitta piana. Di conseguenza, LSFM è lo strumento più idoneo per l’imaging 3D di arborization assone e per la quantificazione dei terminali del nervo motore in embrioni di topo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diversi passaggi nel protocollo possono essere sottoposti a modifiche in determinate circostanze. Ad esempio, la durata della fissazione dipende dall’età degli embrioni, variabile da 2 h a 1 o più giorni utilizzando preparati paraformaldeide. Poiché la fissazione avviene prima dell’intero Monte immunostaining, per gli anticorpi che sono sensibili alla reticolazione della proteina, metanolo può essere usato come agente fissativo alternativo. Per un elevato rapporto segnale-rumore al momento di colorazione, è necessar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
LSFM esperimenti e analisi dei dati sono stati effettuati in parte utilizzando i microscopi ottici avanzati dei divisione di servizio di strumento in Academia Sinica e con l’assistenza di MS. Shu-Chen Shen. Ringraziamo la sig. ra Sue-Ping Lee da impianto di IMB Imaging Core per una notevole assistenza tecnica con analisi dell’immagine Imaris. Nucleo di Editing inglese scientifico di IMB rivisto il manoscritto. Questo lavoro è finanziato dalla Academia Sinica Career Development Award (CDA-107-L05), più (104-2311-B-001-030-MY3) e vi (vi-EX106-10315NC).
Materials
| Hb9::GFP | The Jackson labortory | 005029 | Collect embryos of embryonic day 13.5 (E13.5) |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | For 200ml: Add 20ml 10X PBS, 8g PFA in ddH2O. Adjust pH to 7.4 with NaOH (10N). Filter sterilize and store at -20 °C. | ||
| Phosphate buffer saline 10X (PBS 10X) | For 1L: Add 80 g NaCl, 2 g KCl,14.4g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4 and top up with ddH2O. Autoclave and store at RT. | ||
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 26140079 | |
| Sheep polyclonal anti-GFP | AbD Serotec | 4745-1051 | 1:1000 |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep | Invitrogen | A-11015 | 1:1000 |
| RapiClear 1.47 clearing reagent | SunJin Lab | RC147001 | |
| 1.5ml micro tube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 24 wells plate | ThermoFisher | 142475 | |
| 5 SA Tweezer | ideal-tek | 3480641 | |
| Iris Scissors striaght sharp/sharp | Aesculap | BC110R | |
| Microsurgery Scalpels, single use | Aesculap | BA365 | |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ800 | |
| Shaker | TKS | RS-01 | |
| Lightsheet Z.1 microscope | Carl Zeiss Microscopy | ||
| Imaris 8.4.0 image analysis software | Bitplane, Zurich, Switzerland | ||
| B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J (Hb9::GFP mice) | The Jackson Laboratory | 005029 |
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