모터 축 삭 탐색 및 빛 시트 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 마우스 배아에서 축 삭 Arborization의 정량화의 시각화
Summary
여기, 우리가 모터 뉴런 프로젝션과 유전자 변형 Hb9::GFP 마우스 배아에서 축 삭 arborization 시각화에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 모터 뉴런에 대 한 immunostaining, 후 우리는 후속 정량 분석에 대 한 이미지 배아를 빛 시트 형광 현미경 검사 법 사용. 이 프로토콜은 중앙 신경 조직에 있는 다른 신경 탐색 프로세스에 적용 됩니다.
Abstract
척추 모터 신경 (MNs) 확장 운동과 척추 동물에서 복잡 한 작업을 제어 함으로써 그들의 innervating 목표와 의사 소통을 그들의 축 삭. 따라서, 어떻게 모터 축 삭으로 이동, arborize, 그리고 그들의 주변 근육을 자극을 개발 및 변성 동안 대상의 분자 메커니즘을 밝히기 위해서 중요 하다. 축 삭 터미널 arborization의 전체 스펙트럼에 대 한 자세한 설명은 남아 패턴 복잡성 때문에 불완전 한 유전자 변형 Hb9::GFP 마우스 라인 모터 축 삭 궤도 배아 개발 하는 동안 시각화를 오래 해 왔으나, 비록 고 현재 광학 현미경 검사 법의 제한입니다. 여기, 우리는 빛 시트 형광 현미경 검사 법 (LSFM) 및 질적 및 양적 시각화 모터 축 삭을 개발 하기 위해 강력한 이미지 분석을 결합 하 여 향상 된 프로토콜을 설명 합니다. 이 시스템은 교차 하는 유전 돌연변이 또는 Hb9::GFP 라인, 모터 축 삭 탐색 및 arborization 결함으로 이어질 새로운 분자 메커니즘을 드러내는 미네소타 질병 모델에 쉽게 채택 될 수 있습니다.
Introduction
중앙 신경의 일부인 척수 MNs 하지만 이동을 컨트롤 하기 위해 주변 근육을 자극. 개발 척수에서 미네소타 창시자 (pMNs) notochord 그리고 인접 한 somites에서 나오는 신호에 따라 설정 됩니다. 모든 포스트 mitotic MNs 분화 다음 pMNs, 결국 척수1,2의 rostrocaudal 축 미네소타의 일련에 기한에서 생성 됩니다. 척추 MNs 지형학과 해부학 잘 구성 되어 있습니다. 그들의 형태학 배열 주변3에 그들의 각각 대상의 위치와 상관 한다. 그들의 근육 목표에 도달, axons 수신 확장 하 고 분기 하도록 유도 하는 세포와 외 인 neurotrophic 요인 근육으로. 신경 분포 및 분기 결함 neuromuscular 접속점 (NMJ)를 형성 하는 실패에 기여할 수 있습니다. 예를 들어 폐해 파생 된 neurotrophic 요인 (GDNF)-유도 Pea3은 축 삭 arborization 피부 막시무스 (CM)에 대 한 필수 및 latissimus dorsi (LD) 근육4,5. 또한, 식사 녹아웃 마우스 배아 탄생6,7직후 호흡 실패 및 사망률을 일으키는 횡 경 막에 인할지 신경의 결함 arborization를 표시 합니다. 따라서, 미네소타 성숙 (즉, axonal 프로젝션 및 분기)의이 마지막 단계가 신경 세포와 대상 세포 간의 통신을 보장 하기 위해 중요 합니다.
Arborization 패턴을 보려면, 연구자는 일반적으로 confocal 영상 또는 sectioned 또는 전체 마운트 샘플8,,910의 2 광자 형광 가벼운 현미경 검사 법 실시. 현미경 검사 법 기술을 둘 다 생성 허용 해상도 깊이 침투 합니다. 2-광자 형광 가벼운 현미경 검사 법11두 낮은 에너지 광자 동시 흡수 fluorophores의 흥분을 포함 한다. 두 광자 여기 근처-적외선 방사선을 사용 하 여, 이후 감소 여기 주파수 감소 산란 및 1 m m 더 큰 깊이 가진 이미징 되므로 조직에서에서 더 나은 조직 침투에 기여 한다. Confocal 현미경 검사 법 제거 필터 초점 아웃 신호 및만12초점 비행기 내에서 빛을 수집 합니다. 이 방식으로 Z-스택 기능을 통해 3 차원 (3D) 이미지를 생성 하 다른 초점 비행기에서 샘플의 이미지를 결합 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 신호 강도 빛의 대부분을 차단 하 고 높은 수치 apertures 모호한 필드의 깊이 감소 된다. 더 중요 한 것은, 두 기법 때문에 하나의 비행기는 주어진된 시간에 촬영 하는 경우에 전체 표본 조명 받는 심각한 photodamage 및 phototoxicity에 기여 한다.
이러한 단점을 우회 되 고 빠른, 빛 효율의 장점을 선호 대안 및 더 적은 phototoxic13,14LSFM 되고있다. 또한, LSFM 분할 영상이 있습니다. 이 방식은 모터 축 삭 및 그들의 분산 터미널을 시각화 하는 그들은 3D 공간을 통해 확산에 특히 적합 합니다. LSFM 샘플 수직 축과 x, y 및 z 축을 따라 움직임 회전을 허용 하는 단계에 탑재 되어 있기 때문에 다른 두 가지 옵션을 능가. 이 설정 뿐만 아니라 둘 다 요구 플랫 슬라이드 샘플 장착 샘플의 최소 차단된 보기 뿐만 아니라 바람직한 조명 경로, 2 광자 고 confocal 현미경 검사 법의 단점에 대 한 선택 수 있습니다. 따라서, LSFM는 마우스 배아에 있는 모터 신경 맨끝의 정량화 및 축 삭 arborization의 3D 영상에 대 한 가장 적합 한 도구입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
프로토콜의 여러 단계 특정 상황에서 변화에 대상이 될 수 있습니다. 예를 들어 고정 기간의 2 h에서 1 이상의 일 갓 만든 paraformaldehyde를 사용 하 여 다양 한 태아의 나이에 따라 달라 집니다. 고정 단백질 가교에 민감한 항 체에 대 한 전체 마운트 immunostaining 이전 실시 이후 메탄올 대체 통 요원으로 사용할 수 있습니다. 얼룩에 높은 신호 대 잡음 비율, 그것은 세제 농도 최적화 하는 데 필요한 (사?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
LSFM 실험 및 데이터 분석은 일부를 사용 하 여 악기 서비스의 사단의 고급 광학 현미경 학계 Sinica에서 양 슈 첸 쉔의 원조 하는 것을 수행 했다. 우리는 이미징 핵심 시설의 IMB 상당한 기술 지원 Imaris 이미지 분석에서 양 슈 핑 리 감사합니다. IMB의 과학적인 영어 편집 코어 원고 검토. 이 작품은 학계 Sinica 경력 개발 상 (CDA-107-L05), 가장 (104-2311-B-001-030-MY3), 및 NHRI (NHRI-EX106-10315NC)에 의해 자금을.
Materials
| Hb9::GFP | The Jackson labortory | 005029 | Collect embryos of embryonic day 13.5 (E13.5) |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | For 200ml: Add 20ml 10X PBS, 8g PFA in ddH2O. Adjust pH to 7.4 with NaOH (10N). Filter sterilize and store at -20 °C. | ||
| Phosphate buffer saline 10X (PBS 10X) | For 1L: Add 80 g NaCl, 2 g KCl,14.4g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4 and top up with ddH2O. Autoclave and store at RT. | ||
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 26140079 | |
| Sheep polyclonal anti-GFP | AbD Serotec | 4745-1051 | 1:1000 |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep | Invitrogen | A-11015 | 1:1000 |
| RapiClear 1.47 clearing reagent | SunJin Lab | RC147001 | |
| 1.5ml micro tube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 24 wells plate | ThermoFisher | 142475 | |
| 5 SA Tweezer | ideal-tek | 3480641 | |
| Iris Scissors striaght sharp/sharp | Aesculap | BC110R | |
| Microsurgery Scalpels, single use | Aesculap | BA365 | |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ800 | |
| Shaker | TKS | RS-01 | |
| Lightsheet Z.1 microscope | Carl Zeiss Microscopy | ||
| Imaris 8.4.0 image analysis software | Bitplane, Zurich, Switzerland | ||
| B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J (Hb9::GFP mice) | The Jackson Laboratory | 005029 |
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