मोटर Axon नेविगेशन और माउस के ठहराव में Axon Arborization के दृश्य प्रकाश शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का प्रयोग भ्रूण
Summary
यहां, हम ट्रांसजेनिक Hb9 में मोटर ंयूरॉन प्रक्षेपण और axon arborization visualizing के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन :: GFP माउस भ्रूण । मोटर न्यूरॉन्स के लिए immunostaining के बाद, हम बाद मात्रात्मक विश्लेषण के लिए छवि भ्रूण के लिए प्रकाश शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का इस्तेमाल किया. इस प्रोटोकॉल केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में अंय ंयूरॉन नेविगेशन प्रक्रियाओं के लिए लागू है ।
Abstract
स्पाइनल मोटर न्यूरॉन्स (मनसे) अपने innervating लक्ष्य के साथ संवाद करने के लिए अपने axons का विस्तार, जिससे रीढ़ में आंदोलन और जटिल कार्यों को नियंत्रित. इस प्रकार, यह महत्वपूर्ण है के आणविक तंत्र को उजागर कैसे मोटर axons नेविगेट करने के लिए, arborize, और अंदर आना उनके परिधीय मांसपेशी लक्ष्य के दौरान विकास और अध… हालांकि ट्रांसजेनिक Hb9:: GFP माउस लाइनों लंबे समय के लिए भ्रूण के विकास के दौरान मोटर axon पथ कल्पना सेवा की है, axon टर्मिनल arborization की पूर्ण स्पेक्ट्रम की विस्तृत विवरण पैटर्न जटिलता के कारण अधूरा रह और वर्तमान ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी की सीमाएं । यहाँ, हम गुणात्मक और मात्रात्मक मोटर axons के विकास की कल्पना करने के लिए प्रकाश शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (LSFM) और मजबूत छवि विश्लेषण को जोड़ती है कि एक बेहतर प्रोटोकॉल का वर्णन. इस प्रणाली को आसानी से आनुवंशिक म्यूटेंट या Hb9 के साथ MN रोग मॉडल पार करने के लिए अपनाया जा सकता है :: GFP लाइंस, उपंयास आणविक तंत्र है कि मोटर axon नेविगेशन और arborization में दोषों को जंम खुलासा ।
Introduction
रीढ़ की हड्डी MNs केंद्रीय तंत्रिका तंत्र का हिस्सा है लेकिन अंदर आना परिधीय मांसपेशियों को नियंत्रित करने के लिए आंदोलन कर रहे हैं । विकासशील रीढ़ की हड्डी में, MN progenitors (pMNs) notochord और आसंन somites से उत्पंन संकेतों के अनुसार स्थापित कर रहे हैं । सभी विभेदित पोस्ट-mitotic MNs तो pMNs से उत्पंन कर रहे हैं, अंततः रीढ़ की हड्डी के rostrocaudal अक्ष के साथ MN उपप्रकार की एक श्रृंखला को जंम दे1,2। स्पाइनल अजेंडे स्थलाकृतिक और anatomically अच्छी तरह से आयोजित कर रहे हैं । उनकी रूपात्मक व्यवस्था3परिधि में उनके संबंधित लक्ष्य की स्थिति के साथ संबद्ध है । उनकी मांसपेशी लक्ष्य तक पहुंचने पर, axons सेलुलर और exogenous neurotrophic कारकों प्राप्त है कि उंहें बढ़ाने के लिए प्रेरित और मांसपेशियों में आगे शाखा । इन्नेर्वतिओन और बंटी दोष neuromuscular जंक्शनों (NMJ) के रूप में विफलता के लिए योगदान कर सकते हैं । उदाहरण के लिए, glial व्युत्पंन neurotrophic कारकों (GDNF)-प्रेरित Pea3 axon arborization के लिए त्वचा के नीचे maximus (सेमी) और latissimus डोरसी (LD) मांसपेशियों4,5में अपरिहार्य है । इसके अलावा, भोजन पीटकर माउस भ्रूण डायाफ्राम में phrenic नसों की दोषपूर्ण arborization दिखाने के लिए, सांस की विफलता और जंम के तुरंत बाद मृत्यु6,7। इसलिए, MN परिपक्वता के इस अंतिम चरण (यानी, axonal प्रक्षेपण और शाखाओं में बंटी) ंयूरॉंस और लक्ष्य कोशिकाओं के बीच संचार सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है ।
arborization पैटर्न को देखने के लिए, शोधकर्ताओं ने आम तौर पर फोकल इमेजिंग या दो-फोटॉन प्रतिदीप्ति प्रकाश माइक्रोस्कोपी का संचालन या पूरे माउंट नमूने8,9,10. इन सूक्ष्म तकनीक के दोनों स्वीकार्य संकल्प और गहराई पैठ उत्पंन करते हैं । दो फोटॉन प्रतिदीप्ति प्रकाश माइक्रोस्कोपी दो कम ऊर्जा फोटॉनों11के एक साथ अवशोषण द्वारा fluorophores के उत्तेजना शामिल है । के बाद से दो-फोटॉन उत्तेजना के पास अवरक्त विकिरण का उपयोग करता है, घटी हुई उत्तेजना आवृत्ति को कम तितर बितर और बेहतर ऊतक प्रवेश के लिए योगदान ऊतक में 1 मिमी, इस प्रकार अधिक गहराई के साथ इमेजिंग की अनुमति । फोकल माइक्रोस्कोपी फिल्टर द्वारा बाहर के-फोकस संकेतों को हटा और केवल फोकल विमान12के भीतर प्रकाश एकत्र करता है । इस दृष्टिकोण के साथ, विभिंन फोकल विमानों से नमूनों की छवियों के लिए एक जेड-स्टैक समारोह के माध्यम से एक तीन आयामी (3 डी) छवि का उत्पादन करने के लिए संयुक्त किया जा सकता है । फिर भी, संकेत तीव्रता के रूप में प्रकाश की सबसे कम है अवरुद्ध है और उच्च संख्यात्मक एपर्चर गहराई के क्षेत्र अस्पष्ट । इससे भी महत्वपूर्ण बात, दोनों तकनीक गंभीर धूप और phototoxicity के लिए योगदान के बाद से पूरे नमूना रोशनी प्राप्त करता है, जब केवल एक विमान एक निश्चित समय में imaged है ।
इन कमियों को दरकिनार, LSFM एक इष्ट विकल्प बन गया है, तेजी से होने के फायदे के साथ, प्रकाश कुशल, और कम phototoxic13,14। इसके अलावा, LSFM बहु दृश्य इमेजिंग की अनुमति देता है । इस दृष्टिकोण विशेष रूप से वे 3 डी अंतरिक्ष के माध्यम से फैल के रूप में मोटर axons और उनके dispersing टर्मिनल visualizing के लिए अनुकूल है । LSFM अंय दो विकल्प का प्रदर्शन करता है क्योंकि नमूने एक मंच है कि एक्स, वाई, और जेड अक्षों के साथ एक ऊर्ध्वाधर अक्ष और आंदोलनों के आसपास रोटेशन की अनुमति देता है पर बढ़ रहे हैं । इस सेट अप न केवल नमूने की एक ंयूनतम अवरुद्ध दृश्य के लिए अनुमति देता है, लेकिन यह भी एक वांछनीय रोशनी पथ, दो की एक कमी-फोटॉन और फोकल माइक्रोस्कोपी की पसंद, दोनों जिनमें से एक फ्लैट स्लाइड पर नमूनों के बढ़ते की आवश्यकता होती है । इसलिए, LSFM axon arborization के 3 डी इमेजिंग के लिए सबसे उपयुक्त उपकरण और माउस भ्रूण में मोटर तंत्रिका टर्मिनलों के ठहराव के लिए है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रोटोकॉल में कई कदम कुछ परिस्थितियों में परिवर्तन के अधीन किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, निर्धारण की अवधि भ्रूण की आयु पर निर्भर करती है, 2 ज से 1 या अधिक दिन हौसले से निर्मित paraformaldehyde का उपयोग करने के लिए ब…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
LSFM प्रयोगों और डेटा विश्लेषण भाग में शिक्षा Sinica में साधन सेवा के विभाजन के उंनत ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर और सुश्री शू-चेन शेन की सहायता से किया गया । हम सुश्री मुकदमा-पिंग Imaris छवि विश्लेषण के साथ काफी तकनीकी सहायता के लिए IMB की इमेजिंग कोर सुविधा से ली धंयवाद । IMB के वैज्ञानिक अंग्रेजी संपादन कोर ने पांडुलिपि की समीक्षा की । यह कार्य जगत् Sinica कैरियर विकास पुरस्कार (सीडीए-१०७-L05), सर्वाधिक (104-2311-बी-001-030-MY3), और NHRI (NHRI-EX106-10315NC) द्वारा वित्तपोषित है.
Materials
| Hb9::GFP | The Jackson labortory | 005029 | Collect embryos of embryonic day 13.5 (E13.5) |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | For 200ml: Add 20ml 10X PBS, 8g PFA in ddH2O. Adjust pH to 7.4 with NaOH (10N). Filter sterilize and store at -20 °C. | ||
| Phosphate buffer saline 10X (PBS 10X) | For 1L: Add 80 g NaCl, 2 g KCl,14.4g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4 and top up with ddH2O. Autoclave and store at RT. | ||
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 26140079 | |
| Sheep polyclonal anti-GFP | AbD Serotec | 4745-1051 | 1:1000 |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep | Invitrogen | A-11015 | 1:1000 |
| RapiClear 1.47 clearing reagent | SunJin Lab | RC147001 | |
| 1.5ml micro tube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 24 wells plate | ThermoFisher | 142475 | |
| 5 SA Tweezer | ideal-tek | 3480641 | |
| Iris Scissors striaght sharp/sharp | Aesculap | BC110R | |
| Microsurgery Scalpels, single use | Aesculap | BA365 | |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ800 | |
| Shaker | TKS | RS-01 | |
| Lightsheet Z.1 microscope | Carl Zeiss Microscopy | ||
| Imaris 8.4.0 image analysis software | Bitplane, Zurich, Switzerland | ||
| B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J (Hb9::GFP mice) | The Jackson Laboratory | 005029 |
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