Visualisering Motor Axon navigasjon og kvantifisering av Axon Arborization i Mouse embryoer bruker lys ark fluorescens mikroskopi
Summary
Her beskriver vi en protokoll for å visualisere motoriske nervecellen projeksjon og axon arborization i transgene Hb9::GFP mouse embryoer. Etter immunostaining for motor neurons brukte vi lys ark fluorescens mikroskopi til bildet embryo for påfølgende kvantitativ analyse. Denne protokollen gjelder andre Nevron navigasjon prosesser i sentralnervesystemet.
Abstract
Spinal motor neurons (MNs) utvide deres axons å kommunisere med sine innervating mål, og dermed kontroll bevegelse og komplekse oppgaver i virveldyr. Derfor er det avgjørende å avdekke molekylære mekanismer av hvordan motor axons Gå til arborize og innervate deres eksterne muskel mål under utvikling og degenerasjon. Selv om transgene Hb9::GFP musen linjer har lenge fungert å visualisere motoren axon baner under embryonale utviklingen, detaljerte beskrivelser av hele spekteret av axon terminal arborization fortsatt ufullstendig på grunn av mønsteret kompleksiteten og begrensninger av gjeldende optisk mikroskopi. Her beskriver vi en forbedret protokoll som kombinerer lys ark fluorescens mikroskopi (LSFM) og robust bildeanalyse kvalitativt og kvantitativt visualisere utvikle motorisk axons. Dette systemet kan lett vedtatt for å krysse genetisk mutanter eller MN sykdom modeller med Hb9::GFP linjer, avslørende romanen molekylære mekanismer som fører til motor axon navigasjon og arborization.
Introduction
Spinal MNs inngår i sentralnervesystemet men innervate eksterne muskler for å kontrollere bevegelsen. Utvikle ryggmargen, er MN progenitors (pMNs) opprettet etter signalene kommer fra notochord og tilstøtende somites. Alle differensiert etter mitotisk MNs genereres fra pMNs, til slutt gir opphav til en rekke MN subtyper langs rostrocaudal akse ryggmargen1,2. Spinal MNs er topografisk og anatomisk godt organisert. Deres morfologiske ordning samsvarer med plasseringen av deres respektive mål i periferien3. Ved å nå sine muskler mål, axons motta mobilnettet og eksogene nevrotropisk faktorer som overtale dem til å utvide og gren videre til musklene. Gir og forgrening defekter kan bidra til å danne nevromuskulær veikryss (NMJ). For eksempel glial-avledet nevrotropisk faktorer (GDNF)-indusert Pea3 er uunnværlig for axon arborization i kutan maximus (CM) og vannkalv dorsi (LD) muskler4,5. I tillegg viser DINE knockout mouse embryoer defekt arborization av phrenic nerver i mellomgulvet, forårsaker respirasjonssvikt og dødelighet umiddelbart etter fødselen6,7. Derfor er dette siste trinnet i MN modning (dvs., axonal projeksjon og forgrening) avgjørende for å sikre kommunikasjon mellom nerveceller og målcellene.
Du kan vise arborization mønstre, utfører forskere normalt AC confocal avbildning eller to-fotonet fluorescens * lys av appa-eller hele-mount8,9,10. Begge teknikkene mikroskopi generere akseptabel oppløsning og dyp gjennomtrenging. * To-fotonet fluorescens lys innebærer magnetisering av fluorophores ved samtidige absorpsjon av to nedre-energi fotoner11. Siden to-fotonet eksitasjon bruker nær infrarød stråling, bidrar redusert eksitasjon frekvensen til redusert spredning og bedre vev gjennomtrengning opptil 1 mm i vevet, dermed gir bildebehandling med større dybde. AC confocal mikroskopi fjerner ved filtre ut-av-fokus signaler og samler bare inn lys i fokalplanet12. Med denne tilnærmingen, kan bilder av prøver fra ulike fokal plan kombineres for å gir tredimensjonale (3D) bilder via en Z-stack-funksjonen. Likevel reduseres signalet intensitet som de fleste av lyset er blokkert og høy numeriske blenderåpninger obskure dybde-av-feltet. Enda viktigere, bidrar begge teknikkene til alvorlig photodamage og Phototoksisitet siden hele prøven mottar belysning selv når bare ett plan er avbildet på et gitt tidspunkt.
For å omgå disse svakhetene, har LSFM blitt en favoritt alternativ, med fordelene ved å være rask, lys-effektiv, og mindre fototoksisk13,14. I tillegg gir LSFM flere tenkelig. Denne tilnærmingen er spesielt egnet til visualisere motorisk axons og deres dispersing terminaler som de spre gjennom 3D plass. LSFM utkonkurrerer de andre to alternativene fordi prøver er montert på et stadium som tillater rotasjon rundt en akse og bevegelser langs x-, y- og z-aksene. Dette oppsettet ikke bare tillater for en minimal blokkerte visning av prøven, men også valg av en ønskelig belysning banen, en svakhet for to-fotonet og AC confocal mikroskopi, begge krever montering av eksempler på et flatt lysbilde. Derfor er LSFM det mest passende verktøyet for 3D-bildebehandling av axon arborization og for kvantifisering av motor nerve terminaler i mouse embryoer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Flere trinn i protokollen kan bli utsatt for endringer under visse omstendigheter. For eksempel varigheten av fiksering, avhenger av en alder av embryo, varierer fra 2 h til 1 eller flere dager med nylaget paraformaldehyde. Siden fiksering utføres før hele mount immunostaining, for antistoffer som protein crosslinking, kan metanol brukes som en alternativ etappe, den stabiliserende agent. For en høy signal-til-støy-forhold på flekker, er det nødvendig å optimalisere vaskemiddel konsentrasjonen (mellom 0,1-0,5%). E…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
LSFM eksperimenter og dataanalyse ble utført delvis bruke de avanserte optiske mikroskoper divisjon av Instrument tjenesten i Academia Sinica og med hjelp av Ms. Shu-Chen Shen. Vi takker Ms. Sue-Ping Lee fra den Imaging Core anlegg av IMB for betydelig kundestøtte med Imaris bildeanalyser. IMB vitenskapelige engelsk redigering Core gjennomgått manuskriptet. Dette arbeidet er finansiert av Academia Sinica karriere Development Award (CDA-107-L05), mest (104-2311-B-001-030-MY3) og NHRI (NHRI-EX106-10315NC).
Materials
| Hb9::GFP | The Jackson labortory | 005029 | Collect embryos of embryonic day 13.5 (E13.5) |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | For 200ml: Add 20ml 10X PBS, 8g PFA in ddH2O. Adjust pH to 7.4 with NaOH (10N). Filter sterilize and store at -20 °C. | ||
| Phosphate buffer saline 10X (PBS 10X) | For 1L: Add 80 g NaCl, 2 g KCl,14.4g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4 and top up with ddH2O. Autoclave and store at RT. | ||
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 26140079 | |
| Sheep polyclonal anti-GFP | AbD Serotec | 4745-1051 | 1:1000 |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep | Invitrogen | A-11015 | 1:1000 |
| RapiClear 1.47 clearing reagent | SunJin Lab | RC147001 | |
| 1.5ml micro tube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 24 wells plate | ThermoFisher | 142475 | |
| 5 SA Tweezer | ideal-tek | 3480641 | |
| Iris Scissors striaght sharp/sharp | Aesculap | BC110R | |
| Microsurgery Scalpels, single use | Aesculap | BA365 | |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ800 | |
| Shaker | TKS | RS-01 | |
| Lightsheet Z.1 microscope | Carl Zeiss Microscopy | ||
| Imaris 8.4.0 image analysis software | Bitplane, Zurich, Switzerland | ||
| B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J (Hb9::GFP mice) | The Jackson Laboratory | 005029 |
References
- Davis-Dusenbery, B. N., Williams, L. A., Klim, J. R., Eggan, K. How to make spinal motor neurons. Development. 141, 491-501 (2014).
- Stifani, N. Motor neurons and the generation of spinal motor neuron diversity. Front Cell Neurosci. 8, 293 (2014).
- Kania, A., Jessell, T. M. Topographic motor projections in the limb imposed by LIM homeodomain protein regulation of ephrin-A:EphA interactions. Neuron. 38, 581-596 (2003).
- Livet, J., et al. ETS gene Pea3 controls the central position and terminal arborization of specific motor neuron pools. Neuron. 35, 877-892 (2002).
- Kanning, K. C., Kaplan, A., Henderson, C. E. Motor neuron diversity in development and disease. Annu Rev Neurosci. 33, 409-440 (2010).
- Matsumoto, S., Kiryu-Seo, S., Kiyama, H. Motor Nerve Arborization Requires Proteolytic Domain of Damage-Induced Neuronal Endopeptidase (DINE) during Development. J Neurosci. 36, 4744-4757 (2016).
- Nagata, K., et al. ECEL1 mutation implicates impaired axonal arborization of motor nerves in the pathogenesis of distal arthrogryposis. Acta Neuropathol. 132, 111-126 (2016).
- Catela, C., Shin, M. M., Lee, D. H., Liu, J. P., Dasen, J. S. Hox Proteins Coordinate Motor Neuron Differentiation and Connectivity Programs through Ret/Gfralpha Genes. Cell Rep. 14, 1901-1915 (2016).
- Bonanomi, D., et al. Ret is a multifunctional coreceptor that integrates diffusible- and contact-axon guidance signals. Cell. 148, 568-582 (2012).
- Tung, Y. T., et al. Mir-17 approximately 92 Governs Motor Neuron Subtype Survival by Mediating Nuclear PTEN. Cell Rep. 11, 1305-1318 (2015).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Jonkman, J., Brown, C. M. Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques. J Biomol Tech. 26, 54-65 (2015).
- Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nat Methods. 12, 30-34 (2015).
- Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. J Histochem Cytochem. 59, 129-138 (2011).
- Hanley, O., et al. Parallel Pbx-Dependent Pathways Govern the Coalescence and Fate of Motor Columns. Neuron. 91, 1005-1020 (2016).
- De Marco Garcia, N. V., Jessell, T. M. Early motor neuron pool identity and muscle nerve trajectory defined by postmitotic restrictions in Nkx6.1 activity. Neuron. 57, 217-231 (2008).
- Li, C. J., et al. MicroRNA filters Hox temporal transcription noise to confer boundary formation in the spinal cord. Nat Commun. 8, 14685 (2017).
- Swoger, J., Pampaloni, F., Stelzer, E. H. Light-sheet-based fluorescence microscopy for three-dimensional imaging of biological samples. Cold Spring Harb Protoc. 2014, 1-8 (2014).
- Pantazis, P., Supatto, W. Advances in whole-embryo imaging: a quantitative transition is underway. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 327-339 (2014).
- Reynaud, E. G., Tomancak, P. Meeting report: first light sheet based fluorescence microscopy workshop. Biotechnol J. 5, 798-804 (2010).
