Visualisering av Motor Axon navigering och kvantifiering av Axon Arborization i musembryon som använder ljus ark fluorescensmikroskopi
Summary
Här beskriver vi ett protokoll för att visualisera motorneuronen projektion och axon arborization i transgena Hb9::GFP musembryon. Efter immunfärgning för motoriska nervceller använde vi ljus ark fluorescensmikroskopi bild embryon för efterföljande kvantitativ analys. Detta protokoll är tillämpligt till andra neuron navigering processer i det centrala nervsystemet.
Abstract
Spinal motoriska nervceller (MNs) förlänga deras axoner att kommunicera med sina innervating mål, därmed styra rörelsen och komplexa uppgifter hos ryggradsdjur. Därför är det kritiskt att avslöja molekylära mekanismer för hur motorn axoner navigera till arborize och innerverar deras perifera muskler mål under development och degeneration. Även om transgena Hb9::GFP mus linjer har länge tjänat till att visualisera motor axon banor under fosterutvecklingen, detaljerade beskrivningar av hela spektrumet av axon terminal arborization förblir ofullständig på grund av mönstret komplexitet och begränsningar av nuvarande optisk mikroskopi. Här beskriver vi ett förbättrat protokoll som kombinerar ljus ark fluorescensmikroskopi (LSFM) och robust bildanalys att kvalitativt och kvantitativt visualisera utveckla motoriska axoner. Detta system kan lätt antas för att korsa genetiska mutanter eller MN sjukdomsmodeller med Hb9::GFP linjer, avslöjar nya molekylära mekanismer som leder till fel i motor axon navigering och arborization.
Introduction
Spinal MNs ingår i det centrala nervsystemet men innerverar perifera muskler för att styra rörelsen. Utveckla ryggmärgen, är MN stamfäder (pMNs) etablerade enligt de signaler som kommer från ryggsträng och intilliggande thoraxsegmenten. Alla differentierade efter mitotiska MNs genereras sedan från pMNs, så småningom ger upphov till en rad MN subtyper längs rostrocaudal axeln av ryggmärgen1,2. Spinal MNs anordnas topographically och anatomiskt väl. Deras morfologiska arrangemang korrelerar med placeringen av sina respektive mål i periferin3. Efter att nå koldioxidmålen muskel, axoner får cellulära och exogena neurotrofa faktorer som förmå dem att utvidga och gren längre in muskler. Innervation och förgrenade defekter kan bidra till att bilda neuromuskulära korsningar (NMJ). Exempelvis gliaceller neurotrofa faktorer (GDNF)-inducerad Pea3 är oumbärlig för axon arborization till kutan maximus (CM) och latissimus dorsi (LD) muskler4,5. Dessutom visar DINE knockout musembryon defekta arborization av phrenic nerver i membranen, orsakar andningssvikt och dödlighet omedelbart efter födseln6,7. Det sista steget av MN mognad (dvs, axonal projektion och förgrening) är därför avgörande för att säkerställa kommunikationen mellan nervceller och målceller.
Om du vill visa arborization mönster, genomföra forskare normalt confocal imaging eller ljus två-photon fluorescensmikroskopi av sektionerad eller hela-mount prover8,9,10. Båda dessa mikroskopi tekniker generera acceptabel upplösning och djup penetration. Två-foton fluorescensmikroskopi ljus innebär excitation av fluorophores genom samtidig absorption av två lägre energi fotoner11. Sedan två-photon excitation använder nära-infraröd strålning, bidrar minskad excitation frekvensen till minskad spridning och bättre vävnad penetration upp till 1 mm i vävnaden, vilket möjliggör avbildning med större djup. Konfokalmikroskopi tas bort filter den out-of-fokus signaler och bara samlar ljus inom den fokalplan12. Med detta synsätt, kan bilder av prover från olika focal plan kombineras för att producera en tredimensionell (3D) bild via en Z-stack funktion. Dock reduceras signalintensitet eftersom de flesta av ljuset blockeras och hög numerisk bländare skymma den djup-of-field. Viktigare, bidrar både tekniker till allvarliga photodamage och fototoxicitet eftersom hela preparatet får belysning även när endast en planet är avbildade vid en given tidpunkt.
För att kringgå dessa brister, har LSFM blivit en gynnad alternativ, med fördelarna av att vara snabb, ljus-effektiv, och mindre fototoxisk13,14. LSFM kan dessutom multi-View imaging. Detta tillvägagångssätt är särskilt lämpad att visualisera motoriska axoner och deras spridning terminaler som de sprids genom 3D-rymden. LSFM utklassar de andra två alternativen eftersom prover är monterade på en scen som tillåter rotation kring en vertikal axel och rörelser längs x, y och z-axlarna. Detta upplägg möjliggör inte bara minimalt blockerade utsikt över provet men också valet av en önskvärd belysning sökväg, en brist i två-foton och confocal microscopy, vilka båda kräver montering av prover i en platt bild. LSFM är därför det lämpligaste verktyget för 3D imaging av axon arborization och för kvantifiering av motor nerv terminaler i musembryon.
Protocol
Representative Results
Discussion
Flera steg i protokollet kan bli föremål för ändringar under vissa omständigheter. Till exempel beror fixering varaktighet på ålder av embryon, varierande från 2 h till 1 eller flera dagar med nygjorda PARAFORMALDEHYD. Eftersom fixering utförs före hela mount immunfärgning, för antikroppar som är känsliga för protein crosslinking, kan metanol användas som alternativa fixativ agent. För hög signal-brus-förhållandet vid färgning, är det nödvändigt att optimera tvättmedel koncentration (mellan 0,1-0…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
LSFM experiment och dataanalys utfördes delvis med de avancerade optiska mikroskop av avdelningen av instrumentet tjänster i Academia Sinica och med hjälp av Ms Shu-Chen Shen. Vi tackar Ms. Sue-Ping Lee från Imaging Core Facility av IMBEN för betydande teknisk assistans med Imaris bildanalys. IMBENS vetenskapliga engelska redigering kärna granskade manuskriptet. Detta arbete finansieras av Academia Sinica karriär Development Award (CDA-107-L05), mest (104-2311-B-001-030-MY3) och NHRI (NHRI-EX106-10315NC).
Materials
| Hb9::GFP | The Jackson labortory | 005029 | Collect embryos of embryonic day 13.5 (E13.5) |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | For 200ml: Add 20ml 10X PBS, 8g PFA in ddH2O. Adjust pH to 7.4 with NaOH (10N). Filter sterilize and store at -20 °C. | ||
| Phosphate buffer saline 10X (PBS 10X) | For 1L: Add 80 g NaCl, 2 g KCl,14.4g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4 and top up with ddH2O. Autoclave and store at RT. | ||
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 26140079 | |
| Sheep polyclonal anti-GFP | AbD Serotec | 4745-1051 | 1:1000 |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep | Invitrogen | A-11015 | 1:1000 |
| RapiClear 1.47 clearing reagent | SunJin Lab | RC147001 | |
| 1.5ml micro tube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 24 wells plate | ThermoFisher | 142475 | |
| 5 SA Tweezer | ideal-tek | 3480641 | |
| Iris Scissors striaght sharp/sharp | Aesculap | BC110R | |
| Microsurgery Scalpels, single use | Aesculap | BA365 | |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ800 | |
| Shaker | TKS | RS-01 | |
| Lightsheet Z.1 microscope | Carl Zeiss Microscopy | ||
| Imaris 8.4.0 image analysis software | Bitplane, Zurich, Switzerland | ||
| B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J (Hb9::GFP mice) | The Jackson Laboratory | 005029 |
References
- Davis-Dusenbery, B. N., Williams, L. A., Klim, J. R., Eggan, K. How to make spinal motor neurons. Development. 141, 491-501 (2014).
- Stifani, N. Motor neurons and the generation of spinal motor neuron diversity. Front Cell Neurosci. 8, 293 (2014).
- Kania, A., Jessell, T. M. Topographic motor projections in the limb imposed by LIM homeodomain protein regulation of ephrin-A:EphA interactions. Neuron. 38, 581-596 (2003).
- Livet, J., et al. ETS gene Pea3 controls the central position and terminal arborization of specific motor neuron pools. Neuron. 35, 877-892 (2002).
- Kanning, K. C., Kaplan, A., Henderson, C. E. Motor neuron diversity in development and disease. Annu Rev Neurosci. 33, 409-440 (2010).
- Matsumoto, S., Kiryu-Seo, S., Kiyama, H. Motor Nerve Arborization Requires Proteolytic Domain of Damage-Induced Neuronal Endopeptidase (DINE) during Development. J Neurosci. 36, 4744-4757 (2016).
- Nagata, K., et al. ECEL1 mutation implicates impaired axonal arborization of motor nerves in the pathogenesis of distal arthrogryposis. Acta Neuropathol. 132, 111-126 (2016).
- Catela, C., Shin, M. M., Lee, D. H., Liu, J. P., Dasen, J. S. Hox Proteins Coordinate Motor Neuron Differentiation and Connectivity Programs through Ret/Gfralpha Genes. Cell Rep. 14, 1901-1915 (2016).
- Bonanomi, D., et al. Ret is a multifunctional coreceptor that integrates diffusible- and contact-axon guidance signals. Cell. 148, 568-582 (2012).
- Tung, Y. T., et al. Mir-17 approximately 92 Governs Motor Neuron Subtype Survival by Mediating Nuclear PTEN. Cell Rep. 11, 1305-1318 (2015).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Jonkman, J., Brown, C. M. Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques. J Biomol Tech. 26, 54-65 (2015).
- Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nat Methods. 12, 30-34 (2015).
- Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. J Histochem Cytochem. 59, 129-138 (2011).
- Hanley, O., et al. Parallel Pbx-Dependent Pathways Govern the Coalescence and Fate of Motor Columns. Neuron. 91, 1005-1020 (2016).
- De Marco Garcia, N. V., Jessell, T. M. Early motor neuron pool identity and muscle nerve trajectory defined by postmitotic restrictions in Nkx6.1 activity. Neuron. 57, 217-231 (2008).
- Li, C. J., et al. MicroRNA filters Hox temporal transcription noise to confer boundary formation in the spinal cord. Nat Commun. 8, 14685 (2017).
- Swoger, J., Pampaloni, F., Stelzer, E. H. Light-sheet-based fluorescence microscopy for three-dimensional imaging of biological samples. Cold Spring Harb Protoc. 2014, 1-8 (2014).
- Pantazis, P., Supatto, W. Advances in whole-embryo imaging: a quantitative transition is underway. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 327-339 (2014).
- Reynaud, E. G., Tomancak, P. Meeting report: first light sheet based fluorescence microscopy workshop. Biotechnol J. 5, 798-804 (2010).
