Microscopie de Fluorescence lumière-feuille pour capturer des Images 4-dimensionnelle des effets de modulation de la contrainte de cisaillement sur le coeur de poisson-zèbre en développement
Summary
Nous présentons ici un protocole afin de visualiser le développement des cœurs chez le poisson zèbre en 4 Dimensions (4D). L’imagerie 4D, par l’intermédiaire de la microscopie en fluorescence lumière-feuille (LSFM), prend 3 Dimensions (3d) images au fil du temps, de reconstruire les cœurs en voie de développement. Nous montrons qualitativement et quantitativement que cette contrainte de cisaillement active endocardique Notch signalisation au cours du développement de chambre, qui favorise la trabeculation cardiaque.
Abstract
Les forces hémodynamiques que par le développement cardiaque de coeur influence, surtout trabeculation, qui forme un réseau d’excroissances ramifiées par le myocarde. Programme d’amélioration génétique défauts dans l’encoche de signalisation cascade participent ventriculaires défauts comme la cardiomyopathie Non-Compaction ventriculaire gauche ou Syndrome de coeur gauche hypoplasique. Utilisant ce protocole, il peut être déterminé que la contrainte de cisaillement piloté par trabeculation et la signalisation Notch sont liés à un autre. À l’aide de la microscopie de Fluorescence lumière-feuille, visualisation du poisson-zèbre-coeur en développement a été possible. Dans ce manuscrit, il a cherché à déterminer si les forces hémodynamiques modulent l’ouverture de trabeculation via la signalisation Notch et par conséquent, influer sur la fonction contractile se produit. Qualitative et quantitative de cisaillement analyse des contraintes, 4-D (3-J + temps) images ont été acquises au cours de la morphogenèse cardiaque de poisson-zèbre et fluorecence feuilles lumière intégrée avec 4D synchronisation capturé la motion ventriculaire. La viscosité du sang a été réduite via gata1a– morpholino oligonucléotides (MO) la micro-injection pour diminuer la contrainte de cisaillement, ainsi, down-régulation encoche de signalisation et d’atténuer les trabeculation. Coinjection de Nrg1 ARNm avec gata1a MO a sauvé les gènes liés à l’encoche pour restaurer trabeculation. Pour confirmer la contrainte de cisaillement, piloté par la signalisation Notch des influences trabeculation, contraction de cardiomyocyte a été encore arrêtée via tnnt2a-MO pour réduire les forces hémodynamiques, ainsi, down-régulation des gènes de cible encoche pour développer un non-trabéculé myocarde. Enfin, corroboration des patrons d’expression des gènes sensibles aux contraintes de cisaillement de Notch a été réalisée en soumettant des cellules endothéliales à flux pulsatile. Ainsi, la microscopie de lumière-feuille 4D découvert hémodynamiques forces qui sous-tendent la signalisation Notch et trabeculation présentant de l’intérêt clinique à une cardiomyopathie non-compaction.
Introduction
Forces biomécaniques, telles que la contrainte de cisaillement hémodynamique, sont intimement impliqués dans la morphogenèse des cardiaque. En réponse aux forces de cisaillement hémodynamiques, sillons et crêtes myocardiques se développent dans un réseau trabéculaire ondulants dans l’alignement de la direction de la contrainte de cisaillement dans l’ensemble de l’auriculo-ventriculaire (AV) vanne1. Trabeculation cardiaque est nécessaire d’augmenter la contractilité et la masse myocardique2. Des mutations dans l’encoche, voies de signalisation entraînent des malformations cardiaques congénitales chez les humains et les autres vertébrés3. Par exemple, gata1a4 et tnnt2a5 morpholino oligonucléotides (MO) ont été montrés pour réduire l’érythropoïèse, tandis que l’érythropoïétine (EPO) d’ARNm6 et l’isoprotérénol (ISO)7 augmentent rouge sang cellules et la fréquence cardiaque, respectivement et par conséquent mur contrainte de cisaillement (WSS). En outre, signalisation ErbB2, en aval de l’encoche, favorise cardiomyocyte prolifération et la différenciation pour générer la force contractile, qui à son tour active Notch signalisation8,9. Il est suggéré que la contrainte de cisaillement régit Notch signalisation conduite trabeculation pour le développement ventriculaire. Actuellement, il y a beaucoup d’études qui tentent de mieux comprendre les événements de programmation génétiques conduisant à des malformations cardiaques congénitales (CHD)10,11,12, mais très peu étudient comment les forces mécaniques influencent le coeur formant.
Afin d’étudier les forces mécaniques agissant sur l’endocarde, une surveillance étroite au cours de la période de développement doit être mis en œuvre. Toutefois, il est difficile d’obtenir des images de bonne qualité en vivo battant échantillons en raison de l’inhérence de microscopie traditionnelle13. Afin d’observer l’évolution dans le temps au sein d’un échantillon, physique de sectionnement et de coloration, se doivent donc se produire13,14,15. Bien que la microscopie confocale est largement utilisée pour l’image de la structure 3D d’échantillons14,16, acquisition de ces systèmes d’imagerie est encore limitée par les faibles vitesses de balayage.
La microscopie en fluorescence lumière-feuille (LSFM) est une technique d’imagerie qui permet la visualisation de in vivo des événements dynamiques avec long travail distance13. Cette technique utilise une microscopie fluorescente lumière-feuille pour la section optiquement un échantillon de17. En raison de l’éclairage de seulement une feuille mince de la lumière sur l’échantillon, il y a une réduction de blanchiment photo et photo toxicité13,18. Le grand champ de vue et de longue distance de travail permet de grands échantillons de rester intact, car ils sont imagés13,14,17. Le faible grossissement permet une plus grande surface à être photographiée, tandis que la longue distance de travail permet d’échantillons plus épais être photographié sans compromettre le rapport signal-bruit. De nombreux groupes ont utilisé LSFM image entière embryons17, brains14,18, des muscles et des coeurs19 parmi les autres tissus, montrant les divers types d’échantillons qui peuvent être photographiées.
Bien que des recherches antérieures force de cisaillement hémodynamiques réduite par l’occlusion les pistes flux entrant ou sortant du cœur zebrafish, l’information est exclusivement qualitative. Il en résulte un anormal (troisième chambre bouclage cardiaque diminuée et vanne avec facultés affaiblies formation20. Les images LSFM 4D donnent une nouvelle perspective dans la façon dont le cisaillement hémodynamique forces affectent le développement du tissu cardiaque. Ces forces mécaniques peuvent activer des molécules de signalisation sensibles à la force et induire la formation des crêtes trabéculaires. En raison de l’aspect du temps additionnel d’imagerie 4D, on est capable de suivre les changements dans le développement en temps réel, ce qui pourrait conduire à de nouvelles révélations qui avaient passés inaperçues auparavant. Le poisson-zèbre est un modèle idéal pour l’imagerie parce que les scientifiques peuvent observer un animal vertébré complet contre seulement les interactions cellule-cellule. L’oxygène peut également diffuser à travers l’embryon entier, qui permet un développement se produire sans selon le système vasculaire, à la différence dans le développement chez les mammifères. Même si le coeur de poisson-zèbre ne possède pas les organes pulmonaires, qui exigent un cœur à quatre cavités, il y a un grand nombre de gènes cardiaques qui sont conservées entre les poissons zèbres et l’homme21.
Dans ce manuscrit, nous expliquent comment utiliser la microscopie en fluorescence lumière-feuille d’imager les travées en développement dans les coeurs de poisson-zèbre dans diverses circonstances. Tout d’abord, l’injection de gata1a4 ou tnnt2a5 MOs servaient à bas la viscosité du sang et par conséquent WSS. La morphologie du cœur a été enregistrée puis. Dans un autre groupe de poissons, nous a augmenté le WSS en administrant des ARNm de l’OEB 6 ou isoprotérénol7 et observer les résultats. Nous avons également mené une étude de cellule avec différents débits pulsatile ou oscillant. Après chaque groupe d’imagerie, nous avons constaté que WSS captée par l’endocarde via l’encoche signalisation initiés trabeculation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce protocole, nous avons démontré que l’imagerie 4D peut être utilisé pour suivre le développement d’un réseau trabéculaire en réponse à l’évolution des forces biomécaniques. En particulier, la contrainte de cisaillement expérimentés par les cellules endothéliales initie l’encoche signalisation cascade, qui à son tour favorise la trabeculation. Dans ce manuscrit, nous avons démontré que (1) injection de gata1a MO a diminué l’hématopoïèse et donc il a réduit la contrainte de c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier William Talbot, de l’Université de Stanford pour la fourniture de l’homme Nrg1 ADNc et Deborah Yelon de UCSD pour fournir les WEA mutants de . Les auteurs aimeraient également remercier Cynthia Chen avec acquisition d’images. Cette étude a été financée par des subventions HL118650 NIH (à T.K. Hsiai), HL083015 (de T.K. Hsiai), HD069305 (à N.C. Chi et T.K. Hsiai.), HL111437 (pour Hsiai de T.K. et N.C. Chi), HL129727 (de T.K. Hsiai), T32HL007895 (à R.R. Sevag Packard), HL 134613 (à V. Messerschmidt) et Université du Texas système étoiles financement (de J. Lee).
Materials
| Clontech Hifi PCR pre-mix | Takara | 639298 | PCR mastermix 1.1.1.1, 1.1.1.2, 1.1.1.5, 1.1.2.1, 3.1.4 |
| Human Nrg1 cDNA | Gift from William Talbot, Stanford University, Stanford, California, USA | N/A | Used for trabeculation rescue 1.1.1.3, 1.1.1.4, 1.1.2.1 |
| CFX Connect™ Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855201 | PCR Machine 1.1.1.5, 1.1.1.6, 1.1.2.2, 1.1.3.2 |
| pCS2+ | GE Health | Plasmid used to synthesize mRNA 1.1.2.1, 1.1.2.4, 1.1.2.5 |
|
| Nucleospin purification kit | Clontech | 740609.25 | DNA Purification 1.1.2.3, 1.1.2.4, 1.1.6.2 |
| T4 DNA ligase | Clontech | 2011A | PCR Ligation solution 1.1.2.5 |
| Stellar competent cells | Clontech | 636763 | E. coli cells used for transformation 1.1.2.6, 1.1.3.1, 1.1.3.2 |
| Lipofectamine 2000 transfection reagent | Life Technologies | 11668027 | Transfection reagent 1.1.4 |
| mMessage SP6 kit | Invitrogen | AM1340 | Kit used to synthesize mRNA 1.1.6.3 |
| Aurum Total RNA Mini Kit | Bio-Rad | 7326820 | Purifies RNA 1.1.6.4, 3.1.2 |
| GeneTools 4.3.8 | GeneTools | N/A | Software for primer design 1.2.1, 3.1.3 |
| EPO cDNA | Creative Biogene | CDFH006026 | Increases WSS 1.2.2, 1.2.3, 1.1.7 |
| AG1478 | Sigma-Aldrich | T4182 | ErbB inhibitor 1.3.1 |
| E3 medium | To grow embryos 1.3.1, 1.3.2, 5.1.5 |
||
| DAPT | Sigma-Aldrich | D5942 | γ-secretase inhibitor 1.3.2 |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | Used for mounting embryos 2.1.1.1 |
| ORCA-Flash4.0 LT Digital CMOS camera | Hamamatsu Photonics | C11440-42U | Used to capture Images 2.1.1.2, 2.1.1.3 |
| Amira Software | FEI Software | N/A | Visualized and Analysed images into 3D, and 4D 2.1.5.1.1-2.1.5.2.8 |
| Tricaone mesylate | Sigma-Aldrich | 886-86-2 | Used to humanely sedated or sacrifice embryos 3.1.1 |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708890 | Synthesizes cDNA 3.1.2 |
| Eppendorf 5424 microcentrifuge | Eppendorf | 05-400-005 | Microcentrifuge 4.1.1.3 |
| GI254023X | Sigma-Aldrich | 260264-93-5 | ADAM10 inhibitor 4.1.2, 4.1.3 |
| Isoprenaline hydrochloride | Sigma-Aldrich | I5627 | Isoproterenol increases WSS 5.1.5 |
| MATLAB | Mathworks | N/A | Cardiac mechanics analysis |
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