JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

Yamultma stres gelişmekte olan zebra balığı kalp oransal etkileri 4 boyutlu görüntülerini yakalamak için ışık sayfalık floresans mikroskobu

Published: August 10, 2018
doi:
10.3791/57763
, , , , , , , ,
1Department of Bioengineering,The University of Texas at Arlington, 2Department of Medicine (Cardiology) and Bioengineering,UCLA, 3College of Health Science and Environmental Engineering,Shenzhen Technology University

Summary

Burada, zebra balığı 4-boyutlu (4 D) kalbimizde geliştirme görselleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut. Işık sayfalık floresans mikroskobu (LSFM), üzerinden 4-D görüntüleme gelişmekte olan kalpleri yeniden oluşturmak için zaman içinde 3 boyutlu (3-D) görüntüleri alır. Nitelik ve nicelik endocardial çentik kardiyak trabeculation teşvik odası geliştirme sırasında sinyal kesme stres etkinleştirir gösteriyoruz.

Abstract

Hemodinamik kuvvetleri yaşadığı kalp etkisi kalp geliştirme, özellikle trabeculation, dallanma outgrowths Miyokardiyum üzerinden bir ağ oluşturur. Art arda sıralı sol ventrikül sigara-sıkıştırma kardiyomiyopati veya hipoplastik sol kalp sendromu gibi ventriküler kusur söz konusu sinyal çentik genetik program hataları. Bu iletişim kuralını kullanan, bu kesme tahrik stres trabeculation ve çentik sinyal birbirine bağlı belirlenebilir. Işık sayfalık floresans mikroskobu kullanarak, görsel olarak gelişmekte olan zebra balığı kalp mümkündü. Hemodinamik kuvvetleri çentik sinyal yolu ile trabeculation inisiyasyon modüle ve böylece, contractile işlev etkisi olup olmadığını bu el yazması değerlendirildi oluşur. Nitel ve nicel için kesme gerilme analizi, 4-D (3-D + TIME) görüntüleri zebra balığı kardiyak morfogenez sırasında elde ve entegre ışık sayfalık floresans mikroskobu 4-D eşitleme ile yakalanan ventrikül hareket. Kan viskozite gata1a– morpholino oligonucleotides (MO) mikro-makaslama stres, böylece, azaltmak için enjeksiyon yolu ile sinyal ve trabeculation inceltiyorum çentik aşağı düzenleyen düşürüldü. Nrg1 mRNA gata1a MO ile ortak enjeksiyon çentik ile ilgili genleri trabeculation geri yüklemek için kurtar. Yamultma çentik sinyal tahrik stres etkiler trabeculation onaylamak için cardiomyocyte kasılma daha da tnnt2atutuklandı – hemodinamik kuvvetleri, böylece, azaltmak için MO çentik hedef genlerin aşağı düzenleyen bir sigara-trabeculated geliştirmek Miyokardiyum. Son olarak, kesme stres duyarlı çentik genlerin ifade kalıplarının teyit endotel hücreleri pulsatil akışına subjecting tarafından yapılmıştır. Böylece, 4-D ışık sayfalık mikroskobu hemodinamik kuvvetleri çentik sinyal ve trabeculation klinik önemi için sıkıştırma kardiyomiyopati ile temel ortaya çıkardı.

Introduction

Gibi hemodinamik kesme stres, biyomekanik kuvvetleri yakından kalp morfogenez katılmaktadırlar. Yanıt olarak hemodinamik kesme kuvvetleri, miyokardiyal sırtlar ve yiv kesme stres yönünü ile uyum içinde bir dalga gibi trabeküler ağ atriyoventriküler (AV) Vana1arasında geliştirmek. Kalp trabeculation contractile işlevi ve miyokardiyal kitle2artırmak gereklidir. Konjenital kalp kusurları insanlar ve diğer omurgalı3yolları sinyal çentik mutasyonların neden. Örneğin, gata1a4 ve tnnt2a5 morpholino oligonucleotides (MO) eritropoietin (EPO) mRNA6 ve Isoproterenol (ISO)7 kırmızı kan artırmak iken arttığından, azaltmak için gösterilmiştir hücreleri ve kalp hızı sırasıyla ve bu nedenle kesme stres (WSS) duvar. Ayrıca, ErbB2 akıntı yönünde sinyal çentiği kadınlarda, cardiomyocyte yayılması ve farklılaşma sırayla8,9sinyal çentik etkinleştirir contractile güç oluşturmak için teşvik etmektedir. Bu kesme stres ventrikül gelişimi için tahrik trabeculation sinyal çentik yönetir önerilmektedir. Şu anda, daha konjenital kalp kusurları (KKH)10,11,12‘ ye lider genetik programlama olayları anlamak için girişimi birçok çalışma vardır, ama çok az araştırıyor nasıl mekanik Kuvvetleri şekillendirme kalp etkiler.

Mekanik Kuvvetleri araştırmak amacıyla hareket diyaframdan, gelişim döneminde yakın gözlem uygulanması gerekir. Ancak, in vivo içinde örnekleri nedeniyle geleneksel mikroskobu13inherence yenerek iyi kalitede görüntü elde etmek zordur. Bir örnek içinde zamanla geliştirme gözlemlemek için fiziksel kesit ve boyama, bu nedenle,13,14,15meydana gerekir. Confocal mikroskobu örnekleri14,163 boyutlu yapısını görüntüye yaygın olarak kullanılmasına rağmen bu görüntüleme sistemleri edinme hala yavaş tarama hızlarını sınırlıdır.

Işık sayfalık floresans mikroskobu (LSFM) vivo görselleştirme dinamik olaylar kadar çalışma mesafesi13ile sağlar benzersiz bir görüntüleme tekniğidir. Optik bir örnek17bölüm için bir ışık sayfalık floresan mikroskopi bu tekniği kullanır. Nedeniyle aydınlatma ışık örnek üzerinde ince bir levha fotoğraf ağartma ve fotoğraf toksisite13,18bir azalma vardır. Görünümü ve uzun çalışma mesafesi geniş alan görüntülü13,14,17oldukları gibi bozulmamış kalmak için büyük örnekleri verir. Düşük büyütme, uzun süre yansıması daha büyük bir alanı sağlar çalışma mesafesi sinyal-gürültü oranı ödün vermeden yansıması daha kalın örnekleri sağlar. Birçok grup, LSFM görüntü tüm embriyoların17‘ ye kullandık14,18, kas ve kalpleri19 diğer dokular arasında beyin görüntüsü örnekleri çeşitli türler gösteriliyor.

Zebra balığı kalp giriş veya çıkış parça occluding tarafından azaltılmış hemodinamik kesme kuvvetleri önceki araştırma gösterdi rağmen sadece nitel bilgilerdir. Bir anormal üçüncü odası, azalmış kalp döngü ve Engelli Vana oluşumu20içinde sonuçlanır. 4-D LSFM görüntüleri kalp doku gelişimi etkiler hemodinamik kesme kuvvetleri yol yeni bir bakış açısı vermek. Bu mekanik Kuvvetleri güç duyarlı sinyal molekülleri etkinleştirmek ve trabeküler sırtlar oluşumu teşvik. 4-D görüntüleme ekledi zaman yönü nedeniyle bir daha önce fark edilmeden gitti yeni âyetlerini için neden olabilir gerçek zamanlı geliştirme değişiklikleri izlemek yapabiliyor. Zebra balığı bilim adamları sadece hücre-hücre etkileşimleri karşı tüm omurgalı hayvan gözlemleyebilirsiniz çünkü görüntüleme için ideal bir modeldir. Oksijen aynı zamanda olmadan damar sistemine bağlı olarak, farklı olarak memeli geliştirmede gerçekleşmesi geliştirme sağlar tüm embriyo aracılığıyla yaygın. Zebra balığı kalp dört odacıklı kalp gerektirir, pulmoner organları yoksun olsa bile çok sayıda insan ve zebra balığı21arasında korunmuş kardiyak genlerini var.

Bu makale, ışık sayfalık floresans mikroskobu zebra balığı kalplerine çeşitli koşullar altında gelişen trabekül görüntü için nasıl kullanılacağını açıklar. İlk olarak, enjeksiyon gata1a4 veya tnnt2a5 alt kan viskozite ve bu nedenle WSS MOs kullanıldı. Morfoloji kalp sonra kaydedildi. Balık ayrı bir grup, WSS EPO mRNA6 veya isoproterenol7 yönetmek olarak artan ve sonuçları görülmektedir. Biz aynı zamanda farklı pulsatil veya salınım akış oranları ile bir hücre çalışma yaptık. Her grup görüntüleme sonra WSS endokard çentik üzerinden tarafından hissedilen başlatır trabeculation sinyal bulduk.

Protocol

Aşağıdaki yöntemleri UTA ve UCLA IACUC iletişim kurallarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Bu deneysel grupları ile transgenik Tg(cmlc2:gfp), kullanılan wea (zayıf atrium) veya clo (cloche) mutantlar: (a) vahşi-tipi (WT) denetim, (b) gata1a MO ve (c) tnnt2a MO enjeksiyonları (Tablo 1). Modeli Adı…

Representative Results

LSFM bu el yazması yüksek çözünürlüklü 2-B ve 3-b resim elde etmek için kullanılmıştır. Şekil 1A ve 1B’ da görüldüğü gibi aydınlatma objektif hafif levha örneği’yönlendirir. Hafif levha zayıflık nedeniyle, sadece tek bir uçağı aydınlatılır. Algılama objektif aydınlatma objektif konumlandırılmış dik ve ışıklı uçakta (Şekil 1B) odaklanmıştır. Aydınlatma objektif hafif …

Discussion

Bu protokol için 4-D görüntüleme değişiklikler biyomekanik kuvvetler trabeküler ağ gelişimini izlemek için kullanılabileceğini göstermiştir. Özellikle, endotel hücreleri tarafından deneyimli kesme stres sırayla trabeculation teşvik cascade sinyal çentik başlatır. Bu makale, biz göstermiştir (1) gata1a MO enjeksiyon hematopoiesis azalma ve bu nedenle duvar kesme stres azalır, (2) tnnt2a MO enjeksiyon duvar kesme stres ve (3) wea azaltmak için ventrikül contractile işlevi i…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazar William Talbot insan sağlamak için Stanford Üniversitesi için şükran ifade etmek istiyorum Nrg1 cDNA ve Deborah Yelon üzerinden sağlamak için UCSD için WEA mutantlar. Yazarlar ayrıca Cynthia Chen resim alma ile yardımcı olduğunuz için teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışmada hibe NIH HL118650 (T.K. Hsiai), tarafından desteklenmiştir (için T.K. Hsiai) HL083015, HD069305 (için NC Chi ve T.K. Hsiai.), HL111437 (için NC Chi ve T.K. Hsiai), HL129727 (için T.K. Hsiai), T32HL007895 (için R.R. Sevag Packard), HL 134613 (V. Messerschmidt için) ve University of Texas sistem yıldız (J. Lee) finansman.

Materials

Clontech Hifi PCR pre-mix  Takara  639298 PCR mastermix
1.1.1.1, 1.1.1.2, 1.1.1.5, 1.1.2.1, 3.1.4
Human Nrg1 cDNA Gift from William Talbot, Stanford University, Stanford, California, USA N/A Used for trabeculation rescue
1.1.1.3, 1.1.1.4, 1.1.2.1
CFX Connect™ Real-Time PCR Detection System Bio-Rad 1855201 PCR Machine
1.1.1.5, 1.1.1.6, 1.1.2.2, 1.1.3.2
pCS2+ GE Health Plasmid used to synthesize mRNA
1.1.2.1, 1.1.2.4, 1.1.2.5
Nucleospin purification kit   Clontech 740609.25 DNA Purification
1.1.2.3, 1.1.2.4, 1.1.6.2
T4 DNA ligase  Clontech 2011A PCR Ligation solution
1.1.2.5
Stellar competent cells Clontech 636763 E. coli cells used for transformation
1.1.2.6, 1.1.3.1, 1.1.3.2
Lipofectamine 2000 transfection reagent Life Technologies 11668027 Transfection reagent
1.1.4
mMessage SP6 kit Invitrogen AM1340 Kit used to synthesize mRNA
1.1.6.3
Aurum Total RNA Mini Kit Bio-Rad 7326820 Purifies RNA 
1.1.6.4, 3.1.2
GeneTools 4.3.8 GeneTools N/A Software for primer design
1.2.1, 3.1.3
EPO cDNA Creative Biogene CDFH006026 Increases WSS
1.2.2, 1.2.3, 1.1.7
AG1478 Sigma-Aldrich  T4182 ErbB inhibitor
1.3.1
E3 medium To grow embryos
1.3.1, 1.3.2, 5.1.5
DAPT Sigma-Aldrich  D5942 γ-secretase inhibitor
1.3.2
Agarose  Sigma-Aldrich  A9539 Used for mounting embryos
2.1.1.1
ORCA-Flash4.0 LT Digital CMOS camera Hamamatsu Photonics C11440-42U Used to capture Images
2.1.1.2, 2.1.1.3
Amira Software FEI Software N/A Visualized and Analysed images into 3D, and 4D
2.1.5.1.1-2.1.5.2.8
Tricaone mesylate  Sigma-Aldrich  886-86-2 Used to humanely sedated or sacrifice embryos
3.1.1
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad 1708890 Synthesizes cDNA
3.1.2
Eppendorf 5424 microcentrifuge Eppendorf 05-400-005 Microcentrifuge
4.1.1.3
GI254023X Sigma-Aldrich  260264-93-5 ADAM10 inhibitor
4.1.2, 4.1.3 
Isoprenaline hydrochloride Sigma-Aldrich  I5627 Isoproterenol increases WSS
5.1.5
MATLAB Mathworks N/A Cardiac mechanics analysis
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lee, J., et al. Moving domain computational fluid dynamics to interface with an embryonic model of cardiac morphogenesis. PLoS One. 8 (8), e72924 (2013).
  2. Peshkovsky, C., Totong, R., Yelon, D. Dependence of cardiac trabeculation on neuregulin signaling and blood flow in zebrafish. Dev Dyn. 240 (2), 446-456 (2011).
  3. High, F. A., Epstein, J. A. The multifaceted role of Notch in cardiac development and disease. Nat Rev Genet. 9 (1), 49-61 (2008).
  4. Galloway, J. L., Wingert, R. A., Thisse, C., Thisse, B., Zon, L. I. Loss of Gata1 but Not Gata2 Converts Erythropoiesis to Myelopoiesis in Zebrafish Embryos. Developmental Cell. 8 (1), 109-116 (2005).
  5. Chi, N. C., et al. Cardiac conduction is required to preserve cardiac chamber morphology. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (33), 14662 (2010).
  6. Paffett-Lugassy, N., et al. Functional conservation of erythropoietin signaling in zebrafish. Blood. 110 (7), 2718 (2007).
  7. De Luca, E., et al. ZebraBeat: a flexible platform for the analysis of the cardiac rate in zebrafish embryos. Scientific Reports. 4, 4898 (2014).
  8. Liu, J., et al. A dual role for ErbB2 signaling in cardiac trabeculation. Development. 137 (22), 3867-3875 (2010).
  9. Samsa, L. A., et al. Cardiac contraction activates endocardial Notch signaling to modulate chamber maturation in zebrafish. Development. 142 (23), 4080-4091 (2015).
  10. Li, Y., et al. Global genetic analysis in mice unveils central role for cilia in congenital heart disease. Nature. 521, 520 (2015).
  11. Sifrim, A., et al. Distinct genetic architectures for syndromic and nonsyndromic congenital heart defects identified by exome sequencing. Nature Genetics. 48, 1060 (2016).
  12. Hu, Z., et al. A genome-wide association study identifies two risk loci for congenital heart malformations in Han Chinese populations. Nature Genetics. 45, 818 (2013).
  13. Huisken, J., Stainier, D. Y. R. Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology. Development (Cambridge, England). 136 (12), 1963-1975 (2009).
  14. Panier, T., et al. Fast functional imaging of multiple brain regions in intact zebrafish larvae using Selective Plane Illumination Microscopy. Frontiers in Neural Circuits. 7, 65 (2013).
  15. Lee, E., et al. ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Scientific Reports. 6, 18631 (2016).
  16. Kelley, L. C., et al. Live-cell confocal microscopy and quantitative 4D image analysis of anchor-cell invasion through the basement membrane in Caenorhabditis elegans. Nature Protocols. 12, 2081 (2016).
  17. Lee, J., et al. 4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation. The Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1679-1690 (2016).
  18. Lavagnino, Z., et al. 4D (x-y-z-t) imaging of thick biological samples by means of Two-Photon inverted Selective Plane Illumination Microscopy (2PE-iSPIM). Scientific Reports. 6, 23923 (2016).
  19. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy. Science. 305 (5686), 1007 (2004).
  20. Hove, J. R., et al. Intracardiac fluid forces are an essential epigenetic factor for embryonic cardiogenesis. Nature. 421 (6919), 172-177 (2003).
  21. Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovascular Research. 91 (2), 279-288 (2011).
  22. BioRad. . General Protocol for Western Blotting. 6376, (2018).
  23. GeneTools. . Gene Tools Oligo Design Website. , (2018).
  24. Mullins, M. . Zebrafish Course. , (2013).
  25. Grenander, U. . Probability and Statistics: The Harald Cramér Volume. , (1959).
  26. Fei, P., et al. Cardiac Light-Sheet Fluorescent Microscopy for Multi-Scale and Rapid Imaging of Architecture and Function. Scientific Reports. 6, 22489 (2016).
  27. Liebling, M., Forouhar , A. S., Gharib, M., Fraser, S. E., Dickinson, M. E. Four-dimensional cardiac imaging in living embryos via postacquisition synchronization of nongated slice sequences. Journal of Biomedical Optics. 10 (5), (2005).
  28. Adeoye, A. A., et al. Combined effects of exogenous enzymes and probiotic on Nile tilapia (Oreochromis niloticus) growth, intestinal morphology and microbiome. Aquaculture. 463, 61-70 (2016).
  29. Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and Euthanasia in Zebrafish. ILAR Journal. 53 (2), 192-204 (2012).
  30. Singleman, C., Holtzman, N. G. Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (55), e3165 (2011).
  31. Li, R., et al. Disturbed Flow Induces Autophagy, but Impairs Autophagic Flux to Perturb Mitochondrial Homeostasis. Antioxidants & Redox Signaling. 23 (15), 1207-1219 (2015).
  32. Li, R., et al. Shear Stress-Activated Wnt-Angiopoietin-2 Signaling Recapitulated Vascular Repair in Zebrafish Embryos. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 34 (10), 2268-2275 (2014).
  33. Baek, K. I., et al. Flow-Responsive Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-Protein Kinase C Isoform Epsilon Signaling Mediates Glycolytic Metabolites for Vascular Repair. Antioxidants & Redox Signaling. 28 (1), 31-43 (2018).
  34. Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish. Developmental Dynamics. 228 (1), 30-40 (2003).
  35. Vermot, J., et al. Reversing blood flows act through klf2a to ensure normal valvulogenesis in the developing heart. PLoS Biol. 7 (11), (2009).
  36. Grego-Bessa, J., et al. Notch signaling is essential for ventricular chamber development. Dev Cell. 12 (3), 415-429 (2007).
  37. Berdougo, E., Coleman, H., Lee, D. H., Stainier, D. Y. R., Yelon, D. Mutation of weak atrium/atrial myosin heavy chain disrupts atrial function and influences ventricular morphogenesis in zebrafish. Development. 130 (24), 6121 (2003).
  38. Arnaout, R., et al. Zebrafish model for human long QT syndrome. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (27), 11316-11321 (2007).
  39. Chi, N. C., et al. Genetic and physiologic dissection of the vertebrate cardiac conduction system. PLoS Biol. 6 (5), e109 (2008).
  40. Liao, W., et al. The zebrafish gene cloche acts upstream of a flk-1 homologue to regulate endothelial cell differentiation. Development. 124 (2), 381-389 (1997).
  41. Stainier, D. Y., Weinstein, B. M., Detrich, H. W., Zon, L. I., Fishman, M. C. Cloche, an early acting zebrafish gene, is required by both the endothelial and hematopoietic lineages. Development. 121 (10), 3141-3150 (1995).
  42. Santi, P. A. Light Sheet Fluorescence Microscopy: A Review. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (2), 129-138 (2011).
  43. Engelbrecht, C. J., Stelzer, E. H. Resolution enhancement in a light-sheet-based microscope (SPIM). Optics Letters. 31 (10), 1477-1479 (2006).

Tags

Keywords: Light-sheet Fluorescence Microscopy4D ImagingZebrafish HeartCardiac TrabeculationNotch SignalingComputational AlgorithmCongenital Cardiac Diseases3D ImagingAgarose GelImage Processing
check_url/57763?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Messerschmidt, V., Bailey, Z., Baek, K. I., Ding, Y., Hsu, J. J., Bryant, R., Li, R., Hsiai, T. K., Lee, J. Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart. J. Vis. Exp. (138), e57763, doi:10.3791/57763 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image