JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

Свет лист флуоресцентной микроскопии для захвата 4-мерного изображения эффектов модуляции напряжения сдвига на развивающихся сердце данио рерио

Published: August 10, 2018
doi:
10.3791/57763
, , , , , , , ,
1Department of Bioengineering,The University of Texas at Arlington, 2Department of Medicine (Cardiology) and Bioengineering,UCLA, 3College of Health Science and Environmental Engineering,Shenzhen Technology University

Summary

Здесь мы представляем протокол для визуализации разработки сердца в zebrafish в 4-измерениях (4-D). 4-D изображений, через свет лист флуоресцентной микроскопии (LSFM), занимает 3-мерных изображений (3-D) со временем, чтобы реконструировать развивающихся сердца. Мы покажем, и количественно и качественно, касательное напряжение активирует эндокарда Notch сигнализации во время разработки камеры, которая способствует сердечной trabeculation.

Abstract

Гемодинамические силы сталкиваются сердце влияние сердца развития, особенно trabeculation, который образует сеть ветвления наросты от миокарда. Генетическая программа дефекты в паз, сигнальный Каскад занимаются такие левого желудочка Non-уплотнение кардиомиопатия или синдром сердца гипоплазии левого желудочков дефекты. Используя этот протокол, можно определить, что касательное напряжение инициативе trabeculation и Notch сигнализации связаны друг с другом. С помощью микроскопии флуоресцирования свет лист, Визуализация развивающихся данио рерио сердца было возможно. В этой рукописи, она оценивалась ли гемодинамики силы модулировать начало trabeculation через выемку сигнализации и таким образом, влияние сократительной функции происходит. Для качественного и количественного сдвига стресс анализ, 4-D (3-D + время) изображения были приобретены во время данио рерио сердца морфогенеза и комплексной света лист флуоресцентной микроскопии с 4-D синхронизации захватили желудочков движения. Вязкость крови был сокращен через gata1a– Морфолино олигонуклеотиды (MO) микро инъекции для уменьшения напряжения сдвига, тем самым, вниз регулирующие выемку сигнализации и смягчающих trabeculation. Совместное инъекций Nrg1 мРНК с gata1a MO спасли Notch связанных генов для восстановления trabeculation. Для подтверждения инициативе Notch сигнализации при сдвиге влияния trabeculation, сокращение cardiomyocyte далее был арестован через tnnt2a-MO для уменьшения гемодинамики силы, тем самым, вниз регулирующие выемку целевых генов для разработки не trabeculated миокард. Наконец подтверждения, выражений шаблонов касательное напряжение отзывчивым Notch генов было проведено подвергать пульсирующего потока эндотелиальных клеток. Таким образом микроскопия свет лист 4-D непокрытый гемодинамики силы лежащие в основе Notch сигнализации и trabeculation с клинической значимости для не уплотнение кардиомиопатии.

Introduction

Биомеханические сил, например гемодинамики при сдвиге, тесно вовлечены в сердечной морфогенеза. В ответ на гемодинамические сдвига миокарда гребней и пазов развиваются в волнообразных трабекулярной сети в соответствие с направлением касательное напряжение через предсердно (AV) клапан1. Сердца trabeculation необходимо увеличить сократительной функции и миокарда массовые2. Мутации в паз, сигнальные пути привести врожденных пороков сердца в организме человека и других позвоночных3. Например было показано, уменьшить эритропоэза, эритропоэтин (ЭПО) мРНК6 и7 Isoproterenol (ISO) увеличение красных кровяных gata1a4 и tnnt2a5 Морфолино олигонуклеотиды (MO) клетки и сердечного ритма соответственно и поэтому стены касательное напряжение (WSS). Кроме того ErbB2 сигнализации, вниз по течению выемки, способствует cardiomyocyte пролиферации и дифференцировки сформировать сократительной силы, которая в свою очередь активирует Notch сигнализации8,9. Он предложил что касательное напряжение регулирует Notch сигнализации приводом trabeculation желудочков развития. В настоящее время, существует множество исследований, которые пытаются понять генетического программирования событий, приведших к сердца врожденные дефекты (CHD)10,11,12, но очень мало изучают как формируя сердце влияние механических сил.

Для того чтобы расследовать механических сил, действующих на эндокарда, тщательное наблюдение в период развития должна осуществляться. Однако это является сложной задачей для получения хорошего качества изображения в vivo избиение образцы из-за наследования традиционных микроскопии13. Для того, чтобы наблюдать за развитием со временем в рамках выборки, физические секционирование и окрашивание, поэтому, должны произойти13,14,15. Хотя конфокальная микроскопия широко используется для изображения 3-D структуры образцов14,16, приобретение этих тепловизионных систем по-прежнему ограничивается медленной скорости сканирования.

Свет лист флуоресцентной микроскопии (LSFM) это уникальный изображений техника, которая позволяет визуализировать в естественных условиях динамических событий с длиной рабочей расстояние13. Этот метод использует свет лист флуоресцентной микроскопии для оптически раздел пример17. Из-за освещения только тонкого листа света на образце является снижение отбеливание фото и фото токсичности13,18. Большое поле зрения и рабочим расстоянием позволяет для больших образцов остаются нетронутыми, поскольку они фотосъемка13,14,17. Низкий масштаб позволяет для большей площади для записи образа, а длинный рабочее расстояние позволяет толще образцов для записи образа без ущерба для отношение сигнал шум. Многие группы использовали LSFM для изображения, все эмбрионы17, мозги14,18, мышц и сердца19 среди других тканей, показаны различные виды образцов, которые могут быть образы.

Хотя предыдущие исследования показали снижение гемодинамического поперечной силы поглощения приток или отток треков сердца данио рерио, информация является исключительно качественные. Это приводит к ненормальной третьей камеры, снижение сердечного цикла и нарушением клапан формирования20. 4-D LSFM изображения дают новую перспективу в гемодинамических сдвига силы влияют на путь развития сердечной ткани. Эти механических сил может активировать силы чувствительных сигнальных молекул и стимулировать формирование трабекулярной хребтов. Из-за добавленного времени аспект 4-D изображений одна способна отслеживать изменения в развитии в режиме реального времени, что может привести к новые откровения, которые ранее незамеченным. Данио рерио является идеальной моделью для визуализации потому, что ученые могут наблюдать весь позвоночных животных против только ячеек взаимодействий. Кислород может также диффузных через весь эмбриона, который позволяет развитие происходит без зависимости от сосудистой системы, в отличие от млекопитающих развития. Даже несмотря на то, что сердце данио рерио не хватает легких органов, которые требуют четыре-сердце, существует большое количество сердца генов, которые сохраняются между21данио рерио и людей.

В этой рукописи мы опишем, как использовать свет лист флуоресцентной микроскопии для изображения развивающихся трабекулы в zebrafish сердца при различных обстоятельствах. Во-первых инъекции gata1a4 или tnnt2a5 MOs были использованы для ниже вязкости крови и поэтому WSS. Морфологии сердца, затем был записан. В отдельную группу рыб мы увеличилось WSS управляющими ЕПВ мРНК6 или isoproterenol7 и отметила результаты. Мы также провели исследование клеток с различными пульсирующего или колебательных расхода. После визуализации каждой группы, мы обнаружили, что WSS воспринимается эндокарда через выемку сигнализации начинает trabeculation.

Protocol

Следующие методы были исполнены в соответствии с протоколами Ута и UCLA IACUC. Эти экспериментальные группы были использованы с трансгенных Tg(cmlc2:gfp), wea (слабый Атриум) или clo (cloche) мутантов: управления () одичал тип (WT), (b) gata1a MO и (c) tnnt2a MO инъекции (Таблица 1). <table…

Representative Results

LSFM был использован в этой рукописи для того, чтобы приобрести 2-D и 3-D изображений с высоким разрешением. Как видно на рисунке 1A и 1B, освещение объектива направляет свет лист на образец. Из-за тонкости света листа горит только одной плоскости. Лин?…

Discussion

В этом протоколе мы показали, что 4-D изображений может использоваться для отслеживания развития трабекулярной сети в ответ на изменения в биомеханических сил. В частности касательное напряжение опытных эндотелиальных клеток инициирует паз, сигнальный Каскад, который в свою очередь сп…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы хотели бы выразить благодарность Уильям Талбот Стэнфордского университета для предоставления человека Nrg1 cDNA и Дебора Yelon от UCSD для обеспечения WEA мутантов. Авторы хотели бы также поблагодарить за помощь с приобретением изображений Синтия Чэнь. Это исследование было поддержано грантов низ HL118650 (к Hsiai т.к.), HL083015 (к Hsiai т.к.), HD069305 (чтобы оплата Чи и т.к. Hsiai.), HL111437 (к Hsiai т.к. и оплата Чи), HL129727 (к Hsiai т.к.), T32HL007895 (для р.р. Севак Packard), 134613 HL (чтобы V. Мессершмидта) и Университет Техаса системы звезды финансирования (Джей ли).

Materials

Clontech Hifi PCR pre-mix  Takara  639298 PCR mastermix
1.1.1.1, 1.1.1.2, 1.1.1.5, 1.1.2.1, 3.1.4
Human Nrg1 cDNA Gift from William Talbot, Stanford University, Stanford, California, USA N/A Used for trabeculation rescue
1.1.1.3, 1.1.1.4, 1.1.2.1
CFX Connect™ Real-Time PCR Detection System Bio-Rad 1855201 PCR Machine
1.1.1.5, 1.1.1.6, 1.1.2.2, 1.1.3.2
pCS2+ GE Health Plasmid used to synthesize mRNA
1.1.2.1, 1.1.2.4, 1.1.2.5
Nucleospin purification kit   Clontech 740609.25 DNA Purification
1.1.2.3, 1.1.2.4, 1.1.6.2
T4 DNA ligase  Clontech 2011A PCR Ligation solution
1.1.2.5
Stellar competent cells Clontech 636763 E. coli cells used for transformation
1.1.2.6, 1.1.3.1, 1.1.3.2
Lipofectamine 2000 transfection reagent Life Technologies 11668027 Transfection reagent
1.1.4
mMessage SP6 kit Invitrogen AM1340 Kit used to synthesize mRNA
1.1.6.3
Aurum Total RNA Mini Kit Bio-Rad 7326820 Purifies RNA 
1.1.6.4, 3.1.2
GeneTools 4.3.8 GeneTools N/A Software for primer design
1.2.1, 3.1.3
EPO cDNA Creative Biogene CDFH006026 Increases WSS
1.2.2, 1.2.3, 1.1.7
AG1478 Sigma-Aldrich  T4182 ErbB inhibitor
1.3.1
E3 medium To grow embryos
1.3.1, 1.3.2, 5.1.5
DAPT Sigma-Aldrich  D5942 γ-secretase inhibitor
1.3.2
Agarose  Sigma-Aldrich  A9539 Used for mounting embryos
2.1.1.1
ORCA-Flash4.0 LT Digital CMOS camera Hamamatsu Photonics C11440-42U Used to capture Images
2.1.1.2, 2.1.1.3
Amira Software FEI Software N/A Visualized and Analysed images into 3D, and 4D
2.1.5.1.1-2.1.5.2.8
Tricaone mesylate  Sigma-Aldrich  886-86-2 Used to humanely sedated or sacrifice embryos
3.1.1
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad 1708890 Synthesizes cDNA
3.1.2
Eppendorf 5424 microcentrifuge Eppendorf 05-400-005 Microcentrifuge
4.1.1.3
GI254023X Sigma-Aldrich  260264-93-5 ADAM10 inhibitor
4.1.2, 4.1.3 
Isoprenaline hydrochloride Sigma-Aldrich  I5627 Isoproterenol increases WSS
5.1.5
MATLAB Mathworks N/A Cardiac mechanics analysis
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lee, J., et al. Moving domain computational fluid dynamics to interface with an embryonic model of cardiac morphogenesis. PLoS One. 8 (8), e72924 (2013).
  2. Peshkovsky, C., Totong, R., Yelon, D. Dependence of cardiac trabeculation on neuregulin signaling and blood flow in zebrafish. Dev Dyn. 240 (2), 446-456 (2011).
  3. High, F. A., Epstein, J. A. The multifaceted role of Notch in cardiac development and disease. Nat Rev Genet. 9 (1), 49-61 (2008).
  4. Galloway, J. L., Wingert, R. A., Thisse, C., Thisse, B., Zon, L. I. Loss of Gata1 but Not Gata2 Converts Erythropoiesis to Myelopoiesis in Zebrafish Embryos. Developmental Cell. 8 (1), 109-116 (2005).
  5. Chi, N. C., et al. Cardiac conduction is required to preserve cardiac chamber morphology. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (33), 14662 (2010).
  6. Paffett-Lugassy, N., et al. Functional conservation of erythropoietin signaling in zebrafish. Blood. 110 (7), 2718 (2007).
  7. De Luca, E., et al. ZebraBeat: a flexible platform for the analysis of the cardiac rate in zebrafish embryos. Scientific Reports. 4, 4898 (2014).
  8. Liu, J., et al. A dual role for ErbB2 signaling in cardiac trabeculation. Development. 137 (22), 3867-3875 (2010).
  9. Samsa, L. A., et al. Cardiac contraction activates endocardial Notch signaling to modulate chamber maturation in zebrafish. Development. 142 (23), 4080-4091 (2015).
  10. Li, Y., et al. Global genetic analysis in mice unveils central role for cilia in congenital heart disease. Nature. 521, 520 (2015).
  11. Sifrim, A., et al. Distinct genetic architectures for syndromic and nonsyndromic congenital heart defects identified by exome sequencing. Nature Genetics. 48, 1060 (2016).
  12. Hu, Z., et al. A genome-wide association study identifies two risk loci for congenital heart malformations in Han Chinese populations. Nature Genetics. 45, 818 (2013).
  13. Huisken, J., Stainier, D. Y. R. Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology. Development (Cambridge, England). 136 (12), 1963-1975 (2009).
  14. Panier, T., et al. Fast functional imaging of multiple brain regions in intact zebrafish larvae using Selective Plane Illumination Microscopy. Frontiers in Neural Circuits. 7, 65 (2013).
  15. Lee, E., et al. ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Scientific Reports. 6, 18631 (2016).
  16. Kelley, L. C., et al. Live-cell confocal microscopy and quantitative 4D image analysis of anchor-cell invasion through the basement membrane in Caenorhabditis elegans. Nature Protocols. 12, 2081 (2016).
  17. Lee, J., et al. 4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation. The Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1679-1690 (2016).
  18. Lavagnino, Z., et al. 4D (x-y-z-t) imaging of thick biological samples by means of Two-Photon inverted Selective Plane Illumination Microscopy (2PE-iSPIM). Scientific Reports. 6, 23923 (2016).
  19. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy. Science. 305 (5686), 1007 (2004).
  20. Hove, J. R., et al. Intracardiac fluid forces are an essential epigenetic factor for embryonic cardiogenesis. Nature. 421 (6919), 172-177 (2003).
  21. Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovascular Research. 91 (2), 279-288 (2011).
  22. BioRad. . General Protocol for Western Blotting. 6376, (2018).
  23. GeneTools. . Gene Tools Oligo Design Website. , (2018).
  24. Mullins, M. . Zebrafish Course. , (2013).
  25. Grenander, U. . Probability and Statistics: The Harald Cramér Volume. , (1959).
  26. Fei, P., et al. Cardiac Light-Sheet Fluorescent Microscopy for Multi-Scale and Rapid Imaging of Architecture and Function. Scientific Reports. 6, 22489 (2016).
  27. Liebling, M., Forouhar , A. S., Gharib, M., Fraser, S. E., Dickinson, M. E. Four-dimensional cardiac imaging in living embryos via postacquisition synchronization of nongated slice sequences. Journal of Biomedical Optics. 10 (5), (2005).
  28. Adeoye, A. A., et al. Combined effects of exogenous enzymes and probiotic on Nile tilapia (Oreochromis niloticus) growth, intestinal morphology and microbiome. Aquaculture. 463, 61-70 (2016).
  29. Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and Euthanasia in Zebrafish. ILAR Journal. 53 (2), 192-204 (2012).
  30. Singleman, C., Holtzman, N. G. Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (55), e3165 (2011).
  31. Li, R., et al. Disturbed Flow Induces Autophagy, but Impairs Autophagic Flux to Perturb Mitochondrial Homeostasis. Antioxidants & Redox Signaling. 23 (15), 1207-1219 (2015).
  32. Li, R., et al. Shear Stress-Activated Wnt-Angiopoietin-2 Signaling Recapitulated Vascular Repair in Zebrafish Embryos. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 34 (10), 2268-2275 (2014).
  33. Baek, K. I., et al. Flow-Responsive Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-Protein Kinase C Isoform Epsilon Signaling Mediates Glycolytic Metabolites for Vascular Repair. Antioxidants & Redox Signaling. 28 (1), 31-43 (2018).
  34. Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish. Developmental Dynamics. 228 (1), 30-40 (2003).
  35. Vermot, J., et al. Reversing blood flows act through klf2a to ensure normal valvulogenesis in the developing heart. PLoS Biol. 7 (11), (2009).
  36. Grego-Bessa, J., et al. Notch signaling is essential for ventricular chamber development. Dev Cell. 12 (3), 415-429 (2007).
  37. Berdougo, E., Coleman, H., Lee, D. H., Stainier, D. Y. R., Yelon, D. Mutation of weak atrium/atrial myosin heavy chain disrupts atrial function and influences ventricular morphogenesis in zebrafish. Development. 130 (24), 6121 (2003).
  38. Arnaout, R., et al. Zebrafish model for human long QT syndrome. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (27), 11316-11321 (2007).
  39. Chi, N. C., et al. Genetic and physiologic dissection of the vertebrate cardiac conduction system. PLoS Biol. 6 (5), e109 (2008).
  40. Liao, W., et al. The zebrafish gene cloche acts upstream of a flk-1 homologue to regulate endothelial cell differentiation. Development. 124 (2), 381-389 (1997).
  41. Stainier, D. Y., Weinstein, B. M., Detrich, H. W., Zon, L. I., Fishman, M. C. Cloche, an early acting zebrafish gene, is required by both the endothelial and hematopoietic lineages. Development. 121 (10), 3141-3150 (1995).
  42. Santi, P. A. Light Sheet Fluorescence Microscopy: A Review. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (2), 129-138 (2011).
  43. Engelbrecht, C. J., Stelzer, E. H. Resolution enhancement in a light-sheet-based microscope (SPIM). Optics Letters. 31 (10), 1477-1479 (2006).

Tags

Keywords: Light-sheet Fluorescence Microscopy4D ImagingZebrafish HeartCardiac TrabeculationNotch SignalingComputational AlgorithmCongenital Cardiac Diseases3D ImagingAgarose GelImage Processing
check_url/57763?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Messerschmidt, V., Bailey, Z., Baek, K. I., Ding, Y., Hsu, J. J., Bryant, R., Li, R., Hsiai, T. K., Lee, J. Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart. J. Vis. Exp. (138), e57763, doi:10.3791/57763 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image