Licht-Blatt Fluoreszenz-Mikroskopie, 4-dimensionale Bilder über die Auswirkungen der modulierende Schubspannung auf entwickelnden Zebrafisches Herzen erfassen
Summary
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Entwicklung von Herzen im Zebrafisch in 4 Dimensionen (4D) zu visualisieren. 4-D-Bildgebung, über Licht-Blatt Fluoreszenz-Mikroskopie (LSFM) dauert 3-dimensionale (3D) Bilder im Laufe der Zeit entwickelnde Herzen zu rekonstruieren. Wir zeigen qualitativ und quantitativ die Scherspannung aktiviert endokardialen Kerbe Signalisierung während der Entwicklung der Kammer, die kardiale Trabeculation fördert.
Abstract
Die hämodynamischen Kräfte durch die Herzen Einfluss kardiale Entwicklung, vor allem Trabeculation, bildet ein Netz von verzweigten Auswüchse von Myokard erlebt. Genetisches Programm Mängel in der Kerbe Signalisierung Kaskade ventrikuläre Defekte wie linken Ventricular Non-Compaction-Kardiomyopathie oder hypoplastischen Links-Heart-Syndrom beteiligt sind. Unter Verwendung dieses Protokolls, kann festgestellt werden, dass Schubspannung angetrieben Trabeculation und Notch signaling miteinander verbunden sind. Mit Licht-Blatt Fluoreszenzmikroskopie war Visualisierung der entwickelnden Zebrafisches Herzen möglich. In diesem Manuskript wurde geprüft, ob hämodynamischen Kräfte die Einleitung der Trabeculation über die Kerbe Signalisierung modulieren und somit KONTRAKTILE Funktion beeinflussen auftritt. Für qualitative und quantitative Scheren Spannungsanalyse, 4-D (3-D + Zeit) Bilder wurden während der Zebrafisch kardiale Morphogenese erworben und integrierten Licht-Blatt-Fluoreszenz-Mikroskopie mit 4D Synchronisation erfasst die ventrikuläre Bewegung. Viskosität des Blutes verringerte Down-Regulierung Kerbe Signal- und mildernde Trabeculation über gata1a– Morpholino Oligonucleotides (MO) Mikro-Injektion, Schubspannung, dadurch zu verringern. Co-Injektion von Nrg1 mRNA mit gata1a MO gerettet Kerbe-Genen um die Trabeculation wiederherzustellen. Bestätigen Schubspannung getrieben Notch signaling beeinflusst Trabeculation Cardiomyocyte Kontraktion verhaftet weiter über tnnt2a-MO hämodynamischen Kräfte dabei reduzieren Down-Regulierung Kerbe Zielgene, non-trabekulierte zu entwickeln Myokard. Zu guter Letzt wurde Bestätigung der Expressionsmuster von Scherbeanspruchung reagierende Kerbe Gene von Endothelzellen pulsierender Strömung unterwerfen durchgeführt. So deckte die 4-D-Licht-Blatt-Mikroskopie hämodynamischen Kräfte zugrunde liegenden Kerbe Signal- und Trabeculation mit klinischer Relevanz, nicht-Verdichtung Cardiomyopathy.
Introduction
Biomechanische Kräfte, wie hämodynamische Schubspannung sind kardiale Morphogenese eng beteiligt. In Reaktion auf die hämodynamische Scherkräfte entwickeln myokardialen Rillen und Nuten in einem wellenartigen trabekuläre Netzwerk in Übereinstimmung mit der Richtung der Schubspannung in der ventrikulären (AV) Ventil1. Kardiale Trabeculation ist notwendig, KONTRAKTILE Funktion und myokardialen Masse2zu erhöhen. Mutationen im Notch Signalwege führen angeborene Herzfehler bei Menschen und anderen Wirbeltieren3. Beispielsweise wurden gata1a4 und tnnt2a5 Morpholino Oligonucleotides (MO) gezeigt, Erythropoese, reduzieren, während Erythropoetin (EPO) mRNA6 und Isoproterenol (ISO)7 roten Blutkörperchen zu erhöhen Zellen und Herzfrequenz Wand bzw. daher Scherspannung (WSS). Darüber hinaus ErbB2-Signalisierung, flussabwärts von Notch, fördert die Cardiomyocyte Proliferation und Differenzierung Kontraktionskraft, generieren die Einkerbung8,9Signalisierung wiederum aktiviert. Es wird vorgeschlagen, dass die Schubspannung Notch signaling gesteuerte Trabeculation für ventrikuläre Entwicklung regelt. Derzeit gibt es viele Studien, die versuchen, weiter zu verstehen, die genetische Programmierung Ereignisse auf angeborene Defekte (KHK)10,11,12, aber sehr wenig untersuchen, wie mechanische Kräfte beeinflussen das Umformen Herz.
Um die mechanischen Kräfte untersuchen muss auf Endokards, genaue Beobachtung während der Entwicklungszeit umgesetzt werden. Allerdings ist es schwierig, gute Bildqualität von in Vivo Proben durch die Inhärenz des traditionellen Mikroskopie13schlagen zu erhalten. Um die Entwicklung im Laufe der Zeit innerhalb einer Probe zu beobachten, müssen daher körperliche schneiden und färben,13,14,15auftreten. Obwohl der konfokalen Mikroskopie weit verbreitet ist, die 3-d-Struktur der Proben14,16Bild, ist diese bildgebenden Systemen Erwerb noch durch langsame Scan-Geschwindigkeit begrenzt.
Licht-Blatt Fluoreszenz-Mikroskopie (LSFM) ist eine einzigartige bildgebendes Verfahren, die die Visualisierung von in Vivo dynamischen Events mit lange arbeiten Abstand13ermöglicht. Diese Technik verwendet eine Licht-Blatt Fluoreszenz-Mikroskopie, optisch eine Probe17Abschnitt. Durch Beleuchtung nur eine dünne Folie aus Licht auf die Probe ist ein Rückgang der Foto-Bleichen und Foto Toxizität13,18. Das große Sichtfeld und langem Arbeitsabstand erlaubt für große Proben intakt bleiben, wie sie abgebildeten13,14,17sind. Die geringe Vergrößerung ermöglicht einen größeren Bereich abgebildet werden, während der langen Arbeitsabstand ermöglicht dickere Proben abgebildet werden, ohne das Signal-Rausch-Verhältnis. Viele Gruppen haben LSFM verwendet, um Bild gesamte Embryonen17,14,18, Muskeln und Herz19 unter anderen Geweben, Gehirne, zeigen die vielfältigen Arten von Proben, die abgebildet werden können.
Obwohl die bisherige Forschung reduzierte hämodynamische Querkraft nachgewiesen durch den Zufluss oder Abfluss Spuren der Zebrafisch Herzen verschließen, sind die Informationen ausschließlich qualitative. Es ergibt sich eine abnorme Dritte Kammer, verminderte kardiale looping und beeinträchtigt Ventil Bildung20. Die 4-D LSFM Bilder geben eine neue Perspektive in die Lebensweise, die der hämodynamischen beeinflussen Scherkräfte, die Entwicklung der das Herzgewebe. Diese mechanische Kräfte können Kraft-Sensitive Signalmoleküle aktivieren und induzieren die Bildung von den trabekulären Kämmen. Wegen der Nachspielzeit Aspekt der 4-D-Bildgebung kann man zum Nachverfolgen von Änderungen in der Entwicklung in Echtzeit, die zu neuen Enthüllungen führen könnten, die bisher unbemerkt hatte. Der Zebrabärbling ist ein ideales Modell für imaging, weil Wissenschaftler eine ganze vertebrate Tier im Vergleich zu nur Zell-Zell-Interaktionen beobachten können. Sauerstoff kann auch durch den gesamten Embryo diffundieren die Entwicklung ohne je nach Kreislauf-Systems, im Gegensatz zu Säugetieren Entwicklung auftreten können. Obwohl der Zebrafisch-Herz der pulmonalen Organe, die erfordern ein vier-Kammer-Herz fehlen, gibt es eine große Anzahl von kardialen Gene, die zwischen Menschen und Zebrafisch21konserviert sind.
In diesem Manuskript beschreiben wir, wie Licht-Blatt Fluoreszenzmikroskopie verwenden, um die Entwicklung Trabekel im Zebrafisch Herzen unter verschiedenen Umständen Bild. Zunächst wurden Injektion von gata1a4 oder tnnt2a5 MOs niedriger die Viskosität des Blutes und damit WSS verwendet. Die Morphologie des Herzens wurde dann aufgezeichnet. In einer separaten Gruppe von Fischen wir erhöht die WSS durch Verabreichung von EPO mRNA6 oder Isoproterenol7 und die Ergebnisse zu beobachten. Wir haben auch eine Zelle-Studie mit verschiedenen pulsierender oder oszillierende Durchflussraten. Nach jeder Gruppe imaging, fanden wir, dass WSS durch Endokards über Kerbe spürte Signalisierung Eingeweihten Trabeculation.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Protokoll haben wir gezeigt, dass 4-D-Bildgebung verwendet werden kann, um die Entwicklung der trabekuläre Netzwerk als Reaktion auf Veränderungen der biomechanischen Kräfte zu verfolgen. Insbesondere initiiert die Scherspannung erfahrenen von Endothelzellen die Kerbe Signalkaskade, die wiederum Trabeculation fördert. In dieser Handschrift haben wir gezeigt, dass (1) gata1a MO-Injektion verminderte Blutbildung und daher es reduziert Wand Schubspannung, (2) tnnt2a MO-Injektion gehemmt ventr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten mit William Talbot von der Stanford University für die Bereitstellung des menschliches Dankbarkeit Nrg1 cDNA und Deborah Yelon von UCSD für die Bereitstellung der WEA Mutanten. Die Autoren möchten auch Cynthia Chen Danke für die Hilfe bei der Bildaufnahme. Diese Studie wurde unterstützt durch Zuschüsse NIH HL118650 (zu t. k. Hsiai), HL083015 (zu t. k. Hsiai), HD069305 (zu N.C. Chi und t. k. Hsiai.), HL111437 (zu t. k. Hsiai und NC-Chi), HL129727 (zu t. k. Hsiai), T32HL007895 (zu R.R Sevåg Packard), HL-134613 (zu V. Messerschmidt) und Universität von Texas System STARS Finanzierung (J. Lee).
Materials
| Clontech Hifi PCR pre-mix | Takara | 639298 | PCR mastermix 1.1.1.1, 1.1.1.2, 1.1.1.5, 1.1.2.1, 3.1.4 |
| Human Nrg1 cDNA | Gift from William Talbot, Stanford University, Stanford, California, USA | N/A | Used for trabeculation rescue 1.1.1.3, 1.1.1.4, 1.1.2.1 |
| CFX Connect™ Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855201 | PCR Machine 1.1.1.5, 1.1.1.6, 1.1.2.2, 1.1.3.2 |
| pCS2+ | GE Health | Plasmid used to synthesize mRNA 1.1.2.1, 1.1.2.4, 1.1.2.5 |
|
| Nucleospin purification kit | Clontech | 740609.25 | DNA Purification 1.1.2.3, 1.1.2.4, 1.1.6.2 |
| T4 DNA ligase | Clontech | 2011A | PCR Ligation solution 1.1.2.5 |
| Stellar competent cells | Clontech | 636763 | E. coli cells used for transformation 1.1.2.6, 1.1.3.1, 1.1.3.2 |
| Lipofectamine 2000 transfection reagent | Life Technologies | 11668027 | Transfection reagent 1.1.4 |
| mMessage SP6 kit | Invitrogen | AM1340 | Kit used to synthesize mRNA 1.1.6.3 |
| Aurum Total RNA Mini Kit | Bio-Rad | 7326820 | Purifies RNA 1.1.6.4, 3.1.2 |
| GeneTools 4.3.8 | GeneTools | N/A | Software for primer design 1.2.1, 3.1.3 |
| EPO cDNA | Creative Biogene | CDFH006026 | Increases WSS 1.2.2, 1.2.3, 1.1.7 |
| AG1478 | Sigma-Aldrich | T4182 | ErbB inhibitor 1.3.1 |
| E3 medium | To grow embryos 1.3.1, 1.3.2, 5.1.5 |
||
| DAPT | Sigma-Aldrich | D5942 | γ-secretase inhibitor 1.3.2 |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | Used for mounting embryos 2.1.1.1 |
| ORCA-Flash4.0 LT Digital CMOS camera | Hamamatsu Photonics | C11440-42U | Used to capture Images 2.1.1.2, 2.1.1.3 |
| Amira Software | FEI Software | N/A | Visualized and Analysed images into 3D, and 4D 2.1.5.1.1-2.1.5.2.8 |
| Tricaone mesylate | Sigma-Aldrich | 886-86-2 | Used to humanely sedated or sacrifice embryos 3.1.1 |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708890 | Synthesizes cDNA 3.1.2 |
| Eppendorf 5424 microcentrifuge | Eppendorf | 05-400-005 | Microcentrifuge 4.1.1.3 |
| GI254023X | Sigma-Aldrich | 260264-93-5 | ADAM10 inhibitor 4.1.2, 4.1.3 |
| Isoprenaline hydrochloride | Sigma-Aldrich | I5627 | Isoproterenol increases WSS 5.1.5 |
| MATLAB | Mathworks | N/A | Cardiac mechanics analysis |
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