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Bioengineering

प्रकाश शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी विकासशील Zebrafish दिल पर कतरनी तनाव मॉडुलन के प्रभाव के 4 आयामी छवियों पर कब्जा करने के लिए

Published: August 10, 2018
doi:
10.3791/57763
, , , , , , , ,
1Department of Bioengineering,The University of Texas at Arlington, 2Department of Medicine (Cardiology) and Bioengineering,UCLA, 3College of Health Science and Environmental Engineering,Shenzhen Technology University

Summary

यहां, हम 4-आयाम (4-डी) में zebrafish में दिल के विकास की कल्पना करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं । 4-डी इमेजिंग, प्रकाश शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (LSFM) के माध्यम से, समय के साथ 3 आयामी (3-डी) छवियों लेता है, विकासशील दिलों को फिर से संगठित करने के लिए । हम गुणात्मक और मात्रात्मक बताते है कि कतरनी तनाव endocardial पायदान सक्रिय करता है चैंबर के विकास के दौरान संकेतन, जो हृदय trabeculation को बढ़ावा देता है ।

Abstract

hemodynamic दिल प्रभाव हृदय विकास, विशेष रूप से trabeculation, जो मायोकार्डियम से शाखाओं में बंटी का एक नेटवर्क रूपों द्वारा अनुभवी बलों । आनुवंशिक रूप से संकेतन झरना में कार्यक्रम दोष वेंट्रिकुलर दोषों में शामिल है जैसे वाम वेंट्रिकुलर गैर-संपीड़न Cardiomyopathy या Hypoplastic छोड़ दिया दिल सिंड्रोम । इस प्रोटोकॉल का प्रयोग, यह निर्धारित किया जा सकता है कि कतरनी तनाव trabeculation और पायदान संकेतन प्रेरित एक दूसरे से संबंधित हैं । प्रकाश चादर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग करना, विकासशील zebrafish दिल के दृश्य संभव था । इस पांडुलिपि में, यह आकलन किया गया था कि hemodynamic बलों पायदान संकेतन के माध्यम से trabeculation की दीक्षा मिलाना और इस प्रकार, प्रभाव सिकुड़ा समारोह होता है । गुणात्मक और मात्रात्मक कतरनी तनाव विश्लेषण के लिए, 4 डी (3-डी + समय) छवियों zebrafish कार्डियक morphogenesis के दौरान अधिग्रहीत किया गया था, और 4-डी तुल्यकालन के साथ एकीकृत प्रकाश-पत्र प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी वेंट्रिकुलर गति पर कब्जा कर लिया. रक्त चिपचिपापन gata1a-morpholino oligonucleotides के माध्यम से कम हो गया था (मो) सूक्ष्म इंजेक्शन कतरनी तनाव को कम करने के लिए, जिससे, नीचे पायदान संकेतन और क्षीणन trabeculation को विनियमित. सह gata1a मो के साथ Nrg1 mRNA के इंजेक्शन trabeculation बहाल करने के लिए पायदान से संबंधित जीन बचाया । करने के लिए कतरनी तनाव को प्रेरित पायदान सिग्नलिंग प्रभाव trabeculation की पुष्टि, cardiomyocyte संकुचन आगे tnnt2aके माध्यम से गिरफ्तार किया गया-एमओ hemodynamic बलों को कम करने के लिए, जिससे, नीचे पायदान लक्ष्य जीन को विनियमित करने के लिए एक गैर trabeculated विकसित मायोकार्डियम. अंत में, कतरनी तनाव उत्तरदायी पायदान जीन के अभिव्यक्ति पैटर्न का मंडन endothelial कोशिकाओं को गुणवाला प्रवाह के अधीन द्वारा आयोजित किया गया था । इस प्रकार, 4-डी प्रकाश शीट माइक्रोस्कोपी खुला hemodynamic सेना के निशान अंतर्निहित पायदान संकेतन और गैर के लिए नैदानिक प्रासंगिकता के साथ trabeculation-कॉंपैक्ट cardiomyopathy ।

Introduction

ऐसे hemodynamic कतरनी तनाव के रूप में यांत्रिक बलों, अच्छी तरह से कार्डियक morphogenesis में शामिल हैं । hemodynamic कतरनी बलों, रोधगलन और खांचे के जवाब में अलिंदनिलय संबंधी ब्लॉक (ए वी) वाल्व1भर में कतरनी तनाव की दिशा के साथ संरेखण में एक लहर की तरह trabecular नेटवर्क में विकसित । कार्डियक trabeculation सिकुड़ा समारोह और रोधगलन द्रव्यमान को बढ़ाने के लिए आवश्यक है2. पायदान संकेत मार्ग में उत्परिवर्तनों मानव और अंय रीढ़3में जन्मजात हृदय दोष में परिणाम । उदाहरण के लिए, gata1a4 और tnnt2a5 morpholino oligonucleotides (MO) को erythropoiesis कम दिखाया गया है, जबकि erythropoietin mRNA (ईपीओ)6 और Isoproterenol (ISO)7 वृद्धि लाल रक्त क्रमशः कोशिकाओं और दिल की दर, और इसलिए दीवार कतरनी तनाव (WSS) । इसके अलावा, ErbB2 संकेतन, पायदान के बहाव, cardiomyocyte प्रसार और भेदभाव को बढ़ावा देता है सिकुड़ा बल उत्पंन, जो बारी में8,9संकेतन सक्रिय हो जाता है । यह सुझाव दिया है कि कतरनी तनाव वेंट्रिकुलर विकास के लिए प्रेरित trabeculation संकेत पायदान नियंत्रित करता है । वर्तमान में, वहां कई अध्ययनों कि आगे आनुवंशिक प्रोग्रामिंग जंमजात हृदय दोष (CHD)10,11,12के लिए अग्रणी घटनाओं को समझने की कोशिश कर रहे हैं, लेकिन बहुत कम जांच कर रहे है कैसे यांत्रिक बलों के गठन दिल को प्रभावित करते हैं ।

endocardium पर अभिनय करने वाले यांत्रिक बलों की जांच के लिए, विकासात्मक अवधि के दौरान निकट अवलोकन को कार्यान्वित किए जाने की आवश्यकता है । हालांकि, यह पारंपरिक माइक्रोस्कोपी13के inherence के कारण vivo पिटाई के नमूनों में अच्छी गुणवत्ता छवियों को प्राप्त करने के लिए चुनौतीपूर्ण है. आदेश में समय पर एक नमूना के भीतर विकास का निरीक्षण करने के लिए, शारीरिक अनुभाग और धुंधला, इसलिए,13,14,15होने की जरूरत है । हालांकि फोकल माइक्रोस्कोपी व्यापक रूप से14नमूनों की 3-डी संरचना छवि के लिए प्रयोग किया जाता है,16, इन इमेजिंग ‘ सिस्टम अधिग्रहण अभी भी धीमी गति से स्कैनिंग द्वारा सीमित है ।

लाइट-शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (LSFM) एक अनूठी इमेजिंग तकनीक है जो vivo गतिशील घटनाओं में लंबे समय से काम कर दूरी13के दृश्य की अनुमति देता है । इस तकनीक को एक प्रकाश शीट फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करता है ऑप्टिकली अनुभाग एक नमूना17। रोशनी के केवल नमूने पर प्रकाश की एक पतली चादर के कारण, वहां फोटो-ब्लीचिंग और फोटो विषाक्तता में कमी है13,18। देखने के बड़े क्षेत्र और लंबे समय से काम कर दूरी के लिए बड़े नमूनों के लिए अनुमति देता है बरकरार रहने के रूप में वे13,14,17छवि बना रहे हैं । कम इज़ाफ़ा एक बड़ा क्षेत्र के लिए छवि बनाई जा करने के लिए अनुमति देता है, जबकि लंबे समय से काम कर दूरी के लिए अनुमति देता है मोटा नमूनों के लिए संकेत-शोर अनुपात समझौता किए बिना छवि है । कई समूहों छवि पूरे भ्रूण17, दिमाग14,18, मांसपेशियों और अंय ऊतकों के बीच19 दिलों को LSFM का इस्तेमाल किया है, नमूनों की विविध प्रकार है कि छवि जा सकता है दिखा ।

हालांकि पिछले अनुसंधान zebrafish दिल की बहिर्वाह या बहिर्वाह पटरियों occluding द्वारा कम hemodynamic कतरनी बल का प्रदर्शन किया, जानकारी केवल गुणात्मक है । यह एक असामान्य तीसरे कक्ष में परिणाम, कार्डियक looping कम, और बिगड़ा वाल्व गठन20. 4-डी LSFM छवियां जिस तरह से hemodynamic कतरनी बलों कार्डियक ऊतक के विकास को प्रभावित करने में एक नया परिप्रेक्ष्य दे । इन यांत्रिक बलों बल के प्रति संवेदनशील संकेत अणुओं को सक्रिय करने और trabecular लकीरें के गठन के लिए प्रेरित कर सकते हैं । 4-डी इमेजिंग के जोड़े गए समय पहलू के कारण, एक वास्तविक समय में विकास में परिवर्तन ट्रैक करने में सक्षम है, जो नए खुलासे के लिए ले जा सकता है कि पहले किसी का ध्यान नहीं गया था । zebrafish इमेजिंग के लिए एक आदर्श मॉडल है क्योंकि वैज्ञानिकों केवल सेल सेल बातचीत बनाम एक पूरे हड्डीवाला पशु का पालन कर सकते हैं । ऑक्सीजन भी पूरे भ्रूण है, जो विकास संवहनी प्रणाली पर निर्भर करता है, स्तनधारी विकास के विपरीत बिना होने के लिए अनुमति देता है के माध्यम से फैलाना कर सकते हैं । हालांकि zebrafish दिल फेफड़े के अंगों, जो एक चार चैंबर दिल की आवश्यकता की कमी है, वहां हृदय जीन है कि zebrafish और21मनुष्यों के बीच संरक्षित कर रहे है की एक बड़ी संख्या है ।

इस पांडुलिपि में, हम विभिन्न परिस्थितियों में zebrafish दिलों में विकासशील trabeculae छवि के लिए प्रकाश शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने का वर्णन कैसे. सबसे पहले, gata1a4 या tnnt2a5 राज्यमंत्री के इंजेक्शन के लिए रक्त चिपचिपापन कम करते थे, और इसलिए WSS । इसके बाद दिल की आकृति विज्ञान का दर्जा मिला । मछली के एक अलग समूह में, हम ईपीओ mRNA6 या isoproterenol7 प्रशासन द्वारा WSS वृद्धि हुई है और परिणाम मनाया । हम भी अलग गुणवाला या थरथरानवाला प्रवाह दरों के साथ एक सेल अध्ययन का आयोजन किया । इमेजिंग प्रत्येक समूह के बाद, हमने पाया है कि WSS संकेतन शुरू trabeculation पायदान के माध्यम से endocardium द्वारा महसूस किया ।

Protocol

निंनलिखित तरीकों को उता और UCLA IACUC प्रोटोकॉल के अनुपालन में किया गया । इन प्रायोगिक समूहों का उपयोग ट्रांसजेनिक टीजी (cmlc2: gfp), wea (कमजोर atrium) या clo (cloche) म्यूटेंट: (क) वन्य-प्रकार (WT) नियंत्रण, (ख) gata1a मो, और (ग…

Representative Results

LSFM इस पांडुलिपि में इस्तेमाल के लिए उच्च संकल्प 2 डी और 3 डी तस्वीरें प्राप्त किया गया । के रूप में चित्रा 1a और 1bमें देखा, दीप्ति लेंस नमूना पर प्रकाश चादर का निर्देशन । हल्की ?…

Discussion

इस प्रोटोकॉल में, हमें पता चला है कि 4-डी इमेजिंग के लिए यांत्रिक बलों में परिवर्तन के जवाब में एक trabecular नेटवर्क के विकास को ट्रैक करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । विशेष रूप से, कतरनी तनाव endothelial कोशिकाओ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

लेखक मानव प्रदान करने के लिए स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय से विलियम टालबोट के प्रति कृतज्ञता व्यक्त करना चाहते हैं Nrg1 सीडीएनए प्रदान करने के लिए UCSD से दबोरा Yelon करने के लिए और wea म्यूटेंट । लेखक भी छवि अधिग्रहण के साथ मदद करने के लिए सिंथिया चेन शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । इस अध्ययन को पलाश NIH HL118650 (to तपन Hsiai) द्वारा समर्थित किया गया था, HL083015 (ते तपन Hsiai), HD069305 (ते नेकां ची व तपन Hsiai.), HL111437 (ते तपन Hsiai व नेकां ची), HL129727 (ते तपन Hsiai), T32HL007895 (ते विद्यालयाजवळ. सेवग पैकार्ड), एचएल १३४६१३ (ते वि. Messerschmidt) व टेक्सास विश्वविद्यालय प्रणाली सितारे वित्त पोषण (जे ली के लिए) ।

Materials

Clontech Hifi PCR pre-mix  Takara  639298 PCR mastermix
1.1.1.1, 1.1.1.2, 1.1.1.5, 1.1.2.1, 3.1.4
Human Nrg1 cDNA Gift from William Talbot, Stanford University, Stanford, California, USA N/A Used for trabeculation rescue
1.1.1.3, 1.1.1.4, 1.1.2.1
CFX Connect™ Real-Time PCR Detection System Bio-Rad 1855201 PCR Machine
1.1.1.5, 1.1.1.6, 1.1.2.2, 1.1.3.2
pCS2+ GE Health Plasmid used to synthesize mRNA
1.1.2.1, 1.1.2.4, 1.1.2.5
Nucleospin purification kit   Clontech 740609.25 DNA Purification
1.1.2.3, 1.1.2.4, 1.1.6.2
T4 DNA ligase  Clontech 2011A PCR Ligation solution
1.1.2.5
Stellar competent cells Clontech 636763 E. coli cells used for transformation
1.1.2.6, 1.1.3.1, 1.1.3.2
Lipofectamine 2000 transfection reagent Life Technologies 11668027 Transfection reagent
1.1.4
mMessage SP6 kit Invitrogen AM1340 Kit used to synthesize mRNA
1.1.6.3
Aurum Total RNA Mini Kit Bio-Rad 7326820 Purifies RNA 
1.1.6.4, 3.1.2
GeneTools 4.3.8 GeneTools N/A Software for primer design
1.2.1, 3.1.3
EPO cDNA Creative Biogene CDFH006026 Increases WSS
1.2.2, 1.2.3, 1.1.7
AG1478 Sigma-Aldrich  T4182 ErbB inhibitor
1.3.1
E3 medium To grow embryos
1.3.1, 1.3.2, 5.1.5
DAPT Sigma-Aldrich  D5942 γ-secretase inhibitor
1.3.2
Agarose  Sigma-Aldrich  A9539 Used for mounting embryos
2.1.1.1
ORCA-Flash4.0 LT Digital CMOS camera Hamamatsu Photonics C11440-42U Used to capture Images
2.1.1.2, 2.1.1.3
Amira Software FEI Software N/A Visualized and Analysed images into 3D, and 4D
2.1.5.1.1-2.1.5.2.8
Tricaone mesylate  Sigma-Aldrich  886-86-2 Used to humanely sedated or sacrifice embryos
3.1.1
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad 1708890 Synthesizes cDNA
3.1.2
Eppendorf 5424 microcentrifuge Eppendorf 05-400-005 Microcentrifuge
4.1.1.3
GI254023X Sigma-Aldrich  260264-93-5 ADAM10 inhibitor
4.1.2, 4.1.3 
Isoprenaline hydrochloride Sigma-Aldrich  I5627 Isoproterenol increases WSS
5.1.5
MATLAB Mathworks N/A Cardiac mechanics analysis
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References

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