Lys arks fluorescens mikroskopi å ta 4-dimensjonale bilder av effektene av modulerende skjæring Stress på utvikle sebrafisk hjertet

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å visualisere utvikle hjerter i sebrafisk i 4-dimensjoner (4-D). 4-D tenkelig, via lys arks fluorescens mikroskopi (LSFM), tar 3-dimensjonale (3D) bilder over tid å rekonstruere utvikle hjerter. Vi viser kvalitativt og kvantitativt at skjæring stress aktiverer endocardial hakk signalering under kammeret utvikling, som fremmer cardiac trabeculation.

Abstract

Hemodynamic krefter oppleves av hjertet innflytelse hjerte utvikling, spesielt trabeculation, som danner et nettverk av forgrening utvekster fra myokard. Genetisk programmet mangler i hakket signalering cascade er involvert i ventrikkel defekter som venstre ventrikkel Non-komprimering kardiomyopati eller Hypoplastic venstre hjertet syndrom. Bruker denne protokollen, kan det fastslås at skjæring stress drevet trabeculation og hakk signalene er knyttet til hverandre. Bruk lys arks fluorescens mikroskopi, var visualisering av utvikle sebrafisk hjertet mulig. I dette manuskriptet ble det vurdert om hemodynamic modulerer initiering av trabeculation via hakk signalering og dermed påvirke kontraktile funksjon oppstår. For kvalitativ og kvantitativ skjæring stress analyse, 4-D (3-D + tid) bildene ble anskaffet under sebrafisk cardiac morphogenesis, og integrert lys arks fluorescens mikroskopi med 4-D synkronisering erobret ventrikkel bevegelse. Blod viskositet ble redusert via gata1a– morpholino oligonucleotides (MO) mikro-injeksjon redusere skjæring stress, dermed ned-regulere hakk signalering og dempe trabeculation. Co injeksjon av Nrg1 mRNA med gata1a MO reddet hakk-relaterte gener for å gjenopprette trabeculation. For å bekrefte skjæring stress drevet hakk signalering påvirker trabeculation, cardiomyocyte sammentrekning arrestert videre via tnnt2a-MO å redusere hemodynamic styrker, dermed ned-regulere hakk målet gener å utvikle en ikke-trabeculated myokard. Endelig ble bekreftelse uttrykk mønstre av skjæring stress-responsive hakk gener utført ved å utsette endotelceller til pulsatile flyt. Dermed avdekket 4-D lys arks mikroskopi hemodynamic styrker underliggende hakk signalisering og trabeculation med klinisk relevans til ikke-komprimering kardiomyopati.

Introduction

Biomekaniske styrker, som hemodynamic skjæring stress, er nært forbundet med hjerte morphogenesis. Svar på hemodynamic skjær krefter utvikle hjerteinfarkt rygger og grooves i en bølge-lignende trabekulært nettverk i tråd med retningen til den skjær stresset over atrioventrikulær (AV) ventil¹. CARDIAC trabeculation er nødvendig å øke kontraktile funksjon og hjerteinfarkt masse². Mutasjoner i hakk signalnettverk trasé føre medfødt hjertefeil hos mennesker og andre virveldyr³. For eksempel har gata1a⁴ og tnnt2a⁵ morpholino oligonucleotides (MO) vist seg å redusere erythropoiesis, mens erytropoietin mRNA (EPO)⁶ og Isoproterenol (ISO)⁷ øke rødt blod celler og hjertefrekvens vegg henholdsvis, og derfor skjæring stress (WSS). Videre ErbB2 signalnettverk, nedstrøms av hakk, fremmer cardiomyocyte spredning og differensiering å generere kontraktile kraft, som igjen aktiverer hakk signalering^8,9. Det anbefales at skjæring stress styrer hakk signalering drevet trabeculation for ventrikkel utvikling. Foreløpig det er mange studier som forsøker å videre forstå genetisk programmering hendelser som førte til medfødt hjerte feil (CHD)^10,11,12, men lite undersøker hvordan mekaniske krefter innflytelse danner sentrum.

For å undersøke de mekaniske kreftene må opptrer på endocardium, nær observasjon i løpet av utviklingsperioden implementeres. Men er det utfordrende å få gode bilder av i vivo slo eksempler på grunn av inherence av tradisjonelle mikroskopi¹³. For å observere utviklingen over tid i et utvalg, må fysiske snitting og flekker, derfor oppstår^13,14,15. Selv om AC confocal mikroskopi er mye brukt til bilde 3-D strukturen prøver^14,16, er disse imaging systems oppkjøpet fortsatt begrenset av lav skanning fart.

Lys arks fluorescens mikroskopi (LSFM) er en unik tenkelig teknikk som lar effekten av in vivo dynamiske hendelser med lang arbeider avstand¹³. Denne teknikken bruker en lys arks fluorescerende mikroskopi til optisk delen en eksempel¹⁷. På grunn av belysning av bare et tynt ark av lys på prøven er det en reduksjon i Foto-bleking og foto toksisitet^13,18. Det store feltet og lenge arbeidsavstand gir store prøver å holde intakt som de er fotografert^13,14,17. Lav forstørrelsen gir et større område å avbildes, mens langt arbeidsavstand gir tykkere prøver å bli fotografert uten akkord signal-til-støy-forhold. Mange grupper har brukt LSFM til bildet hele embryo¹⁷, hjerner^14,18, muskler og hjerter¹⁹ blant andre vev, viser de ulike typene prøver som kan avbildes.

Selv om tidligere forskning viste redusert hemodynamic skjæring kraft ved å skjule sporene innstrømning eller utstrømming av sebrafisk hjertet, er informasjonen utelukkende kvalitative. Det resulterer i en unormal tredje kammeret, svekket cardiac løkker og svekket ventil formasjon²⁰. 4-D LSFM bilder gir et nytt perspektiv inn i måten hemodynamic skjær krefter påvirker utviklingen av hjerte vev. Disse mekaniske krefter kan aktivere kraft-sensitive signalnettverk molekyler og indusere dannelsen av den trabekulært rygger. På grunn av det ekstra tidsaspektet av 4-D imaging er man i stand til å spore endringer i utviklingen i sanntid, noe som kan føre til nye avsløringer som hadde gått ubemerket tidligere. Sebrafisk er en ideell modell for imaging fordi forskere kan observere en hele vertebrate dyr versus bare celle-celle interaksjoner. Oksygen kan også diffus gjennom hele fosteret, hvilke innrømmer å skje uten avhengig av vaskulære systemet, i motsetning til i pattedyr utvikling. Selv om sebrafisk hjertet mangler lunge organer, som krever en fire-chambered hjerte, er det mange cardiac gener som er bevart mellom sebrafisk og mennesker²¹.

I dette manuskriptet beskriver vi hvordan du bruker lys arks fluorescens mikroskopi for å image de utvikling trabeculae i sebrafisk hjerter i ulike situasjoner. Først injeksjon gata1a⁴ eller tnnt2a⁵ MOs ble brukt til lavere blod viskositet, og derfor WSS. Morfologi av hjertet ble deretter innspilt. I en egen gruppe av fisk, vi økt i WSS ved å tilsette EPO mRNA⁶ eller isoproterenol⁷ og observerte resultatene. Vi har også gjennomført en celle studie med forskjellige pulsatile eller oscillasjon strømningshastigheter. Etter bildebehandling hver gruppe, fant vi at WSS kjente av endocardium via hakk signalering starter trabeculation.

Protocol

Metodene nedenfor ble utført i samsvar med UTA og UCLA IACUC. Disse eksperimentelle gruppene ble brukt med transgene Tg(cmlc2:gfp), mutanter wea (svak atrium) eller n (cloche) : (a) vill-type (WT) kontroll, (b) gata1a MO og (c) tnnt2a MO injeksjoner (tabell 1). Modell navn Modifisert g…

Representative Results

LSFM ble brukt i dette manuskriptet for å skaffe 2D og 3D-bilder med høy oppløsning. Som vist i figur 1A og 1B, leder belysning linsen lys arket på prøven. På grunn av thinness av lys arket lyser bare et enkelt fly. Gjenkjenning objektivet er plassert vinkelrett på belysning linsen og er fokusert på opplyst flyet (figur 1B). Lys arket på belysning objektiv skanner deretter prøven fra venstre til høyre …

Discussion

I denne protokollen, har vi vist at 4-D bildebehandling kan brukes til å spore utviklingen av et trabekulært nettverk svar på endringer i biomekaniske styrker. Spesielt starter skjær stress erfarne av endotelceller hakket signalering cascade, som igjen fremmer trabeculation. I dette manuskriptet har vi vist at (1) gata1a MO injeksjon redusert hematopoiesis og derfor det redusert veggen skjæring stress, (2) tnnt2a MO injeksjon hemmet ventrikulær kontraktile funksjonen for å redusere veggen skjæri…

Materials

Clontech Hifi PCR pre-mix	Takara	639298	PCR mastermix 1.1.1.1, 1.1.1.2, 1.1.1.5, 1.1.2.1, 3.1.4
Human Nrg1 cDNA	Gift from William Talbot, Stanford University, Stanford, California, USA	N/A	Used for trabeculation rescue 1.1.1.3, 1.1.1.4, 1.1.2.1
CFX Connect™ Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad	1855201	PCR Machine 1.1.1.5, 1.1.1.6, 1.1.2.2, 1.1.3.2
pCS2+	GE Health		Plasmid used to synthesize mRNA 1.1.2.1, 1.1.2.4, 1.1.2.5
Nucleospin purification kit	Clontech	740609.25	DNA Purification 1.1.2.3, 1.1.2.4, 1.1.6.2
T4 DNA ligase	Clontech	2011A	PCR Ligation solution 1.1.2.5
Stellar competent cells	Clontech	636763	E. coli cells used for transformation 1.1.2.6, 1.1.3.1, 1.1.3.2
Lipofectamine 2000 transfection reagent	Life Technologies	11668027	Transfection reagent 1.1.4
mMessage SP6 kit	Invitrogen	AM1340	Kit used to synthesize mRNA 1.1.6.3
Aurum Total RNA Mini Kit	Bio-Rad	7326820	Purifies RNA  1.1.6.4, 3.1.2
GeneTools 4.3.8	GeneTools	N/A	Software for primer design 1.2.1, 3.1.3
EPO cDNA	Creative Biogene	CDFH006026	Increases WSS 1.2.2, 1.2.3, 1.1.7
AG1478	Sigma-Aldrich	T4182	ErbB inhibitor 1.3.1
E3 medium			To grow embryos 1.3.1, 1.3.2, 5.1.5
DAPT	Sigma-Aldrich	D5942	γ-secretase inhibitor 1.3.2
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539	Used for mounting embryos 2.1.1.1
ORCA-Flash4.0 LT Digital CMOS camera	Hamamatsu Photonics	C11440-42U	Used to capture Images 2.1.1.2, 2.1.1.3
Amira Software	FEI Software	N/A	Visualized and Analysed images into 3D, and 4D 2.1.5.1.1-2.1.5.2.8
Tricaone mesylate	Sigma-Aldrich	886-86-2	Used to humanely sedated or sacrifice embryos 3.1.1
iScript cDNA Synthesis Kit	Bio-Rad	1708890	Synthesizes cDNA 3.1.2
Eppendorf 5424 microcentrifuge	Eppendorf	05-400-005	Microcentrifuge 4.1.1.3
GI254023X	Sigma-Aldrich	260264-93-5	ADAM10 inhibitor 4.1.2, 4.1.3
Isoprenaline hydrochloride	Sigma-Aldrich	I5627	Isoproterenol increases WSS 5.1.5
MATLAB	Mathworks	N/A	Cardiac mechanics analysis