תרביות רקמה השחלות כדי לחזות תופעות העכבר השחלה
Summary
בתרביות רקמה השחלות יכול לשמש דגמים של זקיק פיתוח, הביוץ זקיק בהכנת ולציין את מנגנוני הרגולציה של תהליכים דינאמיים השחלות.
Abstract
נקבות יונקים מעת לעת הביוץ הוא מספר כמעט קבוע של oocytes במהלך כל מחזור ייחום. כדי לקיים כזה בהתמדה ובהחלטיות, תקופתיות, רגולציה מתרחש ברמת הציר ההיפותלמוס-יותרת המוח-האשכים והן על פיתוח זקיקים בשחלה. למרות מחקרים פעילים, מנגנוני התפתחות זקיק אינם ברורים בשל מספר הצעדים הכרוכים מהפעלה זקיק הקדמוני רדום עד הביוץ, ובשל במורכבות הרגולציה השונה בכל אחד מהשלבים הזקיקים. כדי לחקור את מנגנוני התפתחות זקיק, ואת הדינמיקה של זקיקים במהלך מחזור ייחום, פיתחנו מודל תרביות רקמה השחלות העכבר יכול לשמש כדי לבחון התפתחות זקיק באמצעות מיקרוסקופ. זקיק שיטתית, כתב-העת ביוץ ופיתוח זקיק בהכנת כל מגורמיה במודל השחלה בתרבית, התנאים תרבות יכולה להיות מאופנן השפעול. . הנה, נדגים את התועלת של שיטה זו של לימוד מנגנוני הרגולציה של התפתחות זקיק ושאר התופעות השחלות.
Introduction
העכבר הנשי השחלות מכילות אלף זקיקים מספר1ולאחר הביוץ תקופתיים מבשיל כ 10 oocytes-בכל מחזור ייחום. זקיקים מסווגים לתוך מספר שלבים התפתחותיים: הבראשיתי, ראשי, משני, antral, ו Graafian זקיקים, תלוי בצורת שכבה תאית granulosa המקיפה כל oocyte. רוב הזקיקים הקדמוני רדום, חלקם מופעלים ולגדול לתוך ראשי זקיקי-כל מחזור ייחום2. לאחר שלב הזקיקים המשני, התפתחות זקיק מוסדר בעיקר על ידי gonadotropins, הזקיקים מגרה הורמון (FSH), הורמון מחלמן (LH). עם זאת, התפתחות זקיק הקדמוני, ראשי היא עצמאית של גונדוטרופין, מנגנוני הרגולציה המפקחים על השלבים האלה נשארים גרוע inderstood3,4,5. בנוסף, גורמי גדילה והורמונים זקיק הקדמוני, ראשי מוסדר על ידי האינטראקציות בין זקיקי6,7. לכן, עלינו לבצע ניתוחים של זקיק dynamics ברקמות השחלה העכבר, חקרה את מנגנוני הרגולציה המשויך שימוש בתרביות רקמה השחלות8,9,10.
במסמך זה, נסקור שתי שיטות דגם השחלות תרביות רקמה. הראשון משמש כדי לנתח זקיק פיתוח על ידי מדידה של אזורים הזקיקים, והשני משמש כדי ללמוד את מנגנון רגולטורי במהלך התפתחות זקיק מוקדמת מן הקדמונים לשלב זקיק משני עם העכברים הטרנסגניים. לצורך ניתוח התפתחות זקיק, בעיקר השתמשנו השחלות של עכברים נקבה 4 – בן שבועיים כי הם מאפשרים קל ויזואליזציה של זקיקים. לזירוז ביוץ תקופתיים ופיתוח מודל ויוו זקיק, אנחנו לשכפל מנחשולים LH ו ביוץ שנצפה זקיק בהכנת, הפרשת אסטרדיול בתנאים תרביות רקמה. תמונות של השחלות בתרבית נלכדו, תהליכי התפתחות של זקיק נותחו על ידי מעקב אחר שינויים באזור הזקיקים. אולם, בניתוח מיקרוסקופיית שדה בהיר, ההבחנה בין הקדמונים ותחילת זקיקים העיקרי היה לא ברור. לכן, פיתחנו שיטת עבודה זקיקים קטנים, ויוכל להבדיל בין הבראשיתי, העיקרית, ותרבותית זקיק המשני של רקמות השחלות באמצעות Oogenesin1 (Oog1) pro3. 9, השחלות העכברים הטרנסגניים R26-ויזת עבודה H2B-mCherry ימים 0 ו- 4 אחרי הלידה11. הביטוי Oog1 לזיהוי ב oocytes לאחר כניסתו מיוזה, והוא עולה בהדרגה עם התפתחות זקיק, המאפשר התבוננות המעבר הבראשיתי זקיקים הראשי באמצעות תמונות בצילום מואץ של רקמת השחלה בתרבית11 ,12. למרות בשיטות מורפולוגיות שימשו ללמוד הגורמים המפעילים הקדמוני זקיקים רדומים13,14,15,16, התפתחות זקיק פיזיולוגיים של השחלות הוא קשה לצפות, ולהישאר ההשפעות של גורמים שונים uncharacterized. השיטות תרבות נוכח נועדו כתובת זו במחסור בזמן אמת בניתוח הגורמים היעד.
במחקר הנוכחי, אנו מעקב אחר התפתחות הזקיקים באמצעות שיטת הדמיה בצילום מואץ, שאפיינה את תהליך התפתחות זקיק. השיטות הרומן שלנו מציעים כלי חסר תקדים עבור חוקר הפיזיולוגיה של השחלות.
Protocol
Representative Results
Discussion
במחקר זה, פיתחנו שתי שיטות חדשות ללימוד פיתוח זקיק של העכבר השחלות. השיטה הראשונה כרוכה תרבות של רקמות הפרוס עכברים בוגרים השחלות ואחריו ניתוח התפתחות זקיק, השנייה כרוכה בשימוש הדמיה בצילום מואץ להמחיש את התפתחות מוקדמת זקיק בשלב גונדוטרופין עצמאית. בעבר, אנחנו להשתמש בשיטת תרביות רקמה ה?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים Naojiro ד ר אמסטרדם (אוניברסיטת קיוטו) על מתן העכברים Oog1pro3.9 . מחקר זה נתמך על ידי את JSPS (KAKENHI # JP15H06275) ושל קרן Nitto.
Materials
| Follicle stimulating hormone from human pituitary | SIGMA | F4021 | |
| Lutenizing hormone from equine pituitary | SIGMA | L9773 | |
| Penicillin-streptomycin solution | Wako Pure Chemical Industries | 168-23191 | |
| MEM a, GlutaMax, no nucleotides | Thermo Fisher | 32561037 | |
| Glass bottom dish | MatTek | P35G-0-10-C | 35mm dish, No. 0 coverslip, 10mm glass diameter |
| Millicell cell culture insert | Merck Millipore | PICM0RG50 | Diameter: 315 mm, pore size: 0.4 mm, material: hydrophilic PTTE |
| 3.5cm cell culture dishes | greiner bio-one | 627160 | |
| 50ml / centrifuge tube with triple seal cap | IWAKI | 2345-050 | |
| Low-profile disposable blades 819 | Leica | 14035838925 | |
| LSM 710 | Carl Zeiss | Confocal microscope | |
| CellVoyager, CV1000 | Yokogawa Electric Corporation | Time-lapse imaging | |
| BZ-X700 | KEYENCE | Time-lapse imaging |
References
- Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G., Ebling, F. J., Kerr, J. B. Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary. Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).
- Adams, G. P., Jaiswal, R., Singh, J., Malhi, P. Progress in understanding ovarian follicular dynamics in cattle. Theriogenology. 69 (1), 72-80 (2008).
- Palma, G. A., et al. Biology and biotechnology of follicle development. Sci World J. , (2012).
- Knight, P. G., Glister, C. TGF-beta superfamily members and ovarian follicle development. Reproduction. 132 (2), 191-206 (2006).
- Picton, H. M., Harris, S. E., Muruvi, W., Chambers, E. L. The in vitro growth and maturation of follicles. Reproduction. 136 (6), 703-715 (2008).
- Spears, N., de Bruin, J. P., Gosden, R. G. The establishment of follicular dominance in co-cultured mouse ovarian follicles. J Reprod Fertil. 106 (1), 1-6 (1996).
- Baker, S. J., Srsen, V., Lapping, R., Spears, N. Combined effect of follicle-follicle interactions and declining follicle-stimulating hormone on murine follicle health in vitro. Biol Reprod. 65 (4), 1304-1310 (2001).
- Komatsu, K., et al. Analysis of the Effect of Leukemia Inhibitory Factor on Follicular Growth in Cultured Murine Ovarian Tissue. Biol Reprod. 93 (1), 18 (2015).
- Komatsu, K., Masubuchi, S. The concentration-dependent effect of progesterone on follicle growth in the mouse ovary. J Reprod Dev. 63 (3), 271-277 (2017).
- Murase, T., et al. Follicle dynamics: visualization and analysis of follicle growth and maturation using murine ovarian tissue culture. J Assist Reprod Genet. , 1-5 (2017).
- Ishida, M., et al. The promoter of the oocyte-specific gene, Oog1, functions in both male and female meiotic germ cells in transgenic mice. PLoS One. 8 (7), 68686 (2013).
- Minami, N., et al. Oogenesin is a novel mouse protein expressed in oocytes and early cleavage-stage embryos. Biol Reprod. 69 (5), 1736-1742 (2003).
- Nilsson, E. E., Skinner, M. K. Growth and differentiation factor-9 stimulates progression of early primary but not primordial rat ovarian follicle development. Biol Reprod. 67 (3), 1018-1024 (2002).
- Nilsson, E. E., Kezele, P., Skinner, M. K. Leukemia inhibitory factor (LIF) promotes the primordial to primary follicle transition in rat ovaries. Mol Cell Endocrinol. 188 (1-2), 65-73 (2002).
- Nilsson, E. E., Skinner, M. K. Bone morphogenetic protein-4 acts as an ovarian follicle survival factor and promotes primordial follicle development. Biol Reprod. 69 (4), 1265-1272 (2003).
- Nilsson, E. E., Skinner, M. K. Kit ligand and basic fibroblast growth factor interactions in the induction of ovarian primordial to primary follicle transition. Mol Cell Endocrinol. 214 (1-2), 19-25 (2004).
- Abe, T., et al. Establishment of conditional reporter mouse lines at ROSA26 locus for live cell imaging. Genesis. 49 (7), 579-590 (2011).
- Lan, Z. J., Xu, X., Cooney, A. J. Differential oocyte-specific expression of Cre recombinase activity in GDF-9-iCre, Zp3cre, and Msx2Cre transgenic mice. Biol Reprod. 71 (5), 1469-1474 (2004).
- Payer, B., et al. Generation of stella-GFP transgenic mice: a novel tool to study germ cell development. Genesis. 44 (2), 75-83 (2006).
- Ohinata, Y., Sano, M., Shigeta, M., Yamanaka, K., Saitou, M. A comprehensive, non-invasive visualization of primordial germ cell development in mice by the Prdm1-mVenus and Dppa3-ECFP double transgenic reporter. Reproduction. 136 (4), 503-514 (2008).
