난소 조직 문화 현상을 마우스 난소에서 시각화 하

Summary

난소 조직 문화 여 포 개발, 배 란, 그리고 여 포가 폐쇄 증의 모델로 사용할 수 있습니다 하 고 동적 난소 프로세스의 규제 메커니즘을 나타냅니다.

Abstract

포유류 암컷은 정기적으로 각 발 정기 주기 동안 oocytes의 거의 일정 한 수 배 란. 이러한 규칙과 주기 유지, 규정 hypothalamic-뇌 하 수 체-gonadal 축 수준 및 난소에서 난 포 개발에 발생 합니다. 활성 연구에도 불구 하 고 여러 단계 휴면 원시 여 포 활성화에서 배 란을 및 각 소 낭 모양 단계에서 다른 규제 복잡성 때문에 여 포 개발 메커니즘이 명확 하지 않다. 여 포 발달의 기계 장치 그리고 발 정기 주기 낭의 역학 조사, 우리는 관찰 하는 현미경을 사용 하 여 여 포 개발 하는 데 사용할 수 있는 마우스 난소 조직 문화 모델을 개발 했다. 체계적인 여 포 개발, 정기 배 란 및 여 포가 폐쇄 증 모두 재생 될 수 있다 경작된 난소 모델에 그리고 문화 조건을 실험적으로 변조 될 수 있습니다. 여기, 우리 여 포 개발의 규제 메커니즘 및 다른 난소 현상의 연구에서이 방법의 유용성을 보여 줍니다.

Introduction

여성 마우스 난소 포함 몇 천 포¹, 그리고 주기적인 배 란 각 발 정기 주기에서 약 10 oocytes를 성숙. 낭 여러 발달 단계로 분류 됩니다: 원시, 기본, 보조, antral, 및 각 oocyte 둘러싸고 granulosa 세포 층의 형태에 따라 Graafian 낭. 대부분 원시 낭은 휴면, 그들 중 일부는 활성화 하 고 각 발 정기 주기²주 낭으로 성장. 보조 소 낭 모양 단계 후 여 포 개발은 주로 gonadotropins, follicular 자극 호르몬 (FSH)과 황 호르몬 (LH)에 의해 규제 됩니다. 그러나, 원시 및 기본 모 근 개발 생식 샘 자극 호르몬, 독립적 이며 이러한 단계를 제어 하는 규제 메커니즘 남아 제대로 inderstood^3,,45. 성장 인자와 호르몬, 원시 및 기본 여 포 여 포^6,7간의 상호 작용에 의해 통제 된다. 따라서, 우리가 마우스 난소 조직, 뿌리 역동성의 분석을 수행 하 고 난소 조직 문화^8,,910을 사용 하 여 관련된 규제 메커니즘을 조사 합니다.

여기, 두 개의 난소 조직 문화 모델 방법을 소개합니다. 첫 번째 follicular 분야의 측정에 의해 여 포 개발 분석 하 사용 되 고 두 번째는 유전자 변형 마우스 보조 뿌리 단계로 원시에서 초기 여 포 개발 하는 동안 규제 메커니즘을 연구 하는 데 사용 됩니다. 여 포 개발 분석, 우리가 주로 사용 4 주 오래 된 여성 쥐의 난소 낭의 쉽게 시각화를 허용 하기 때문에. 정기 배 란 및 모델 vivo에서 여 포 개발 유도, 우리 LH 서 지 및 관찰된 배 란, 여 포는이 폐쇄 증, 및 조직 배양 조건에서 estradiol의 분 비를 재현. 교양된 난소의 이미지 체포 되었다, 그리고 여 포 개발 프로세스 follicular 지역 변경 내용을 추적 하 여 분석 되었다. 그러나, 밝은 분야 현미경 검사 법 분석, 원시 및 초기 기본 모 공 사이의 구별 불분명 했다. 따라서, 우리 작은 낭을 감지 하 고 원시, 기본, 사이 구별 하는 방법을 개발 하 고 보조 뿌리에 배양 난소 조직을 사용 하 여 Oogenesin1 (Oog1) pro3. 9 그리고 0와 4 일 탄생¹¹후 R26-H2B-mCherry 유전자 변형 쥐 난소. Oog1 식 oocytes에서 감지 감수 분열, 입국 후 고 주 낭 교양된 난소 조직의^{11 시간 경과 이미지를 사용 하 여 원시에서 전환의 관찰 수 있도록 뿌리 발달로 점차 증가 ,12}. 형태학 상 방법을 휴면 원시 낭^13,14,,1516활성화 요인 연구에 사용 되었습니다, 하지만 난소에 생리 여 포 개발은 관찰 하기 어려운 다양 한 요인의 효과 유지 새롭거나. 현재 문화 방법 실시간으로 분석 대상 요소의이 부족을 해결 하기 위해 설계 되었습니다.

현재 연구에서 우리가 follicular 개발 시간 경과 화상 진 찰 방법을 사용 하 여 추적 하 고 여 포 개발 과정 특징. 우리의 소설 메서드는 전례 없는 난소의 생리학을 조사 하기 위한 도구를 제공 합니다.

Protocol

마우스는 23 ± 1 ° C 12 h 빛/12 h 어두운 사이클 환경 제어 실에서 보관 되어 있었다. 동물 보호 프로토콜 및 실험 아이치 의과대학에서 동물 실험에 대 한 지침에 따라 실시 했다 고 현 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 했다. 1입니다. 배양 및 요리 준비 기본적인 문화 매체를 준비 하려면 추가 태아 둔감 한 혈 청 (FBS, 5 %v / v), FSH (100 mIU/mL), LH (10 mU/mL), 그리고 페니실?…

Representative Results

그림 1 난소 조직 문화 중 미디어에서 변경에 대 한 프로토콜을 보여 줍니다. 이 프로그램, 4 주 된 ICR 마우스 난소 배양 되었고 24 시간 간격으로 confocal 현미경 검사 법 (그림 2)를 사용 하 여 몇 군데. 3 주 동안 난소 조직의 문화, 동안 가장 antral 및 보조 모 공 여 포가 폐쇄 증으로 전락 했다 고 일부 ovulated (그림 2<…

Discussion

이 연구에서 우리는 마우스 난소의 여 포 개발을 공부 하는 두 가지 새로운 방법 개발. 첫 번째 방법은 포함 한다 여 포 개발의 분석 뒤 슬라이스 난소 성인 쥐 조직의 문화 그리고 생식 샘 자극 호르몬 독립 단계 초기 여 포 개발을 시각화 하 시간 경과 화상 진 찰의 사용을 포함 하는 두 번째. 이전에 우리 여 포 개발^8,9, 백혈병 금지 요인 및 호르몬의 효?…

Materials

Follicle stimulating hormone from human pituitary	SIGMA	F4021
Lutenizing hormone from equine pituitary	SIGMA	L9773
Penicillin-streptomycin solution	Wako Pure Chemical Industries	168-23191
MEM a, GlutaMax, no nucleotides	Thermo Fisher	32561037
Glass bottom dish	MatTek	P35G-0-10-C	35mm dish, No. 0 coverslip, 10mm glass diameter
Millicell cell culture insert	Merck Millipore	PICM0RG50	Diameter: 315 mm, pore size: 0.4 mm, material: hydrophilic PTTE
3.5cm cell culture dishes	greiner bio-one	627160
50ml / centrifuge tube with triple seal cap	IWAKI	2345-050
Low-profile disposable blades 819	Leica	14035838925
LSM 710	Carl Zeiss		Confocal microscope
CellVoyager, CV1000	Yokogawa Electric Corporation		Time-lapse imaging
BZ-X700	KEYENCE		Time-lapse imaging