Colture del tessuto ovarici possono essere utilizzati come modelli di atresia di sviluppo, l'ovulazione e follicolo pilifero e indicare i meccanismi regolatori dei processi dinamici ovarici.
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Articolo metodologico
Coltura del tessuto ovarico per visualizzare fenomeni nell'ovaia di Mouse
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le femmine dei mammiferi ovulano periodicamente un numero quasi costante degli ovociti durante ogni ciclo di estro. Per sostenere tale regolarità e periodicità, la regolazione avviene a livello ipotalamico-pituitario-gonadico e sullo sviluppo di follicoli nell'ovaio. Nonostante studi attiva, meccanismi per lo sviluppo del follicolo non sono chiari a causa dei diversi passaggi coinvolti dall'attivazione dormienti follicolo primordiale all'ovulazione e a causa della complessità del regolamento che è diverso in ogni fase follicolare. Per studiare i meccanismi di sviluppo del follicolo e le dinamiche dei follicoli durante tutto il ciclo di estro, abbiamo sviluppato un modello di coltura del tessuto ovarico del mouse che può essere usato per osservare lo sviluppo del follicolo tramite un microscopio. Sviluppo sistematico del follicolo, l'ovulazione periodica ed atresia del follicolo può essere riprodotto nel modello dell'ovaia coltivate, e le condizioni della coltura possono essere modulate sperimentalmente. Qui, noi dimostrare l'utilità di questo metodo nello studio dei meccanismi di regolazione dello sviluppo del follicolo e altri fenomeni ovarici.
Introduzione
Mouse femminile ovaie contengono parecchie migliaia di follicoli1, e l'ovulazione periodica matura circa dieci ovociti ad ogni ciclo di estro. Follicoli sono classificati in diversi stadi di sviluppo: primordial, primaria, secondaria, antral e follicoli di Graaf, a seconda della forma dello strato cellulare granulosa che circondano ogni ovocita. Maggior parte dei follicoli primordiali sono dormienti, e alcuni di essi sono attivati e crescere in follicoli primari a ogni ciclo di estro2. Dopo la fase follicolare secondaria, sviluppo del follicolo è regolato principalmente da gonadotropine, follicolare di stimolazione dell'....
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Protocollo
Topi sono stati alloggiati in una stanza in ambiente controllata a 23 ± 1 ° C con un ciclo di 12 h luce/12 h scuro. Protocolli di cura degli animali e gli esperimenti sono stati condotti in conformità con le linee guida per la sperimentazione animale all'Università di Aichi Medical e sono stati approvati dal comitato di uso e Animal Care incombente.
1. preparazione del terreno di coltura e piatti
- Per preparare il terreno di coltura di base, aggiungere siero bovino fetale (FBS, 5% v/v), FSH (100 mIU/mL), LH (10 mU/mL) e la penicillina-streptomicina (penicillina, 100 U/mL; streptomicina, 100 mg/mL) al minimo essenziale medio (MEM-al....
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Risultati
La figura 1 Mostra il protocollo per i cambiamenti nei mezzi di comunicazione durante la coltura del tessuto ovarico. Seguendo questo programma, le ovaie di topi ICR 4-settimana-vecchio erano coltivate e ripreso a intervalli di 24-h usando la microscopia confocale (Figura 2). Durante la coltura dei tessuti dell'ovaia per 3 settimane, più follicoli antrali e secondari sono stati degenerati da atresia del follicolo e alcuni erano o.......
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Discussione
In questo studio, abbiamo sviluppato due nuovi metodi per studiare lo sviluppo del follicolo nelle ovaie del mouse. Il primo metodo comporta la cultura dei tessuti di topi adulti ovarico affettato seguita da analisi dello sviluppo del follicolo, e il secondo prevede l'utilizzo di time-lapse imaging per visualizzare lo sviluppo iniziale del follicolo durante la fase di gonadotropina-indipendente. In precedenza, abbiamo usato il presente metodo di coltura del tessuto ovario per valutare l'effetto di fattore inibitorio di l.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo il Dr. Naojiro Minami (Kyoto University) per fornire i topi Oog1pro3.9 . Questa ricerca è stata sostenuta da JSP (KAKENHI # JP15H06275) e la Fondazione di Nitto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Ormone follicolo-stimolante dall'ipofisi umana | SIGMA | F4021 | |
| Ormone luteinizzante dall'ipofisi equina | SIGMA | L9773 | |
| Soluzione di penicillina-streptomicina | Wako Pure Chemical Industries | 168-23191 | |
| MEM a, GlutaMax, senza nucleotidi | Thermo Fisher | 32561037 | |
| Piatto con fondo in vetro | MatTek | P35G-0-10-C | Piatto da 35 mm, vetrino coprioggetti n. 0, diametro del vetro 10 mm |
| Inserto per colture cellulari Millicell | Merck Millipore | PICM0RG50 | Diametro: 315 mm, dimensione dei pori: 0,4 mm, materiale: PTTE idrofilo |
| Piastre per colture cellulari da 3,5 cm | Greiner Bio-One | 627160 | |
| 50ml / provetta da centrifuga con tappo a tripla tenuta | IWAKI | 2345-050 | |
| Lame monouso a basso profilo 819 | Leica | 14035838925 | |
| LSM 710 | Carl Zeiss | Microscopio confocale | |
| CellVoyager, CV1000 | Yokogawa Electric Corporation | Imaging time-lapse | |
| BZ-X700 | KEYENCE | Imaging time-lapse |
Riferimenti
- Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G., Ebling, F. J., Kerr, J. B. Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary. Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).
- Adams, G. P., Jaiswal, R., Singh, J., Malhi, P. Progress in understanding ovarian follicular dynamics in cattle.<....
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Ristampe e permessi
