Coltura del tessuto ovarico per visualizzare fenomeni nell'ovaia di Mouse
Summary
Colture del tessuto ovarici possono essere utilizzati come modelli di atresia di sviluppo, l’ovulazione e follicolo pilifero e indicare i meccanismi regolatori dei processi dinamici ovarici.
Abstract
Le femmine dei mammiferi ovulano periodicamente un numero quasi costante degli ovociti durante ogni ciclo di estro. Per sostenere tale regolarità e periodicità, la regolazione avviene a livello ipotalamico-pituitario-gonadico e sullo sviluppo di follicoli nell’ovaio. Nonostante studi attiva, meccanismi per lo sviluppo del follicolo non sono chiari a causa dei diversi passaggi coinvolti dall’attivazione dormienti follicolo primordiale all’ovulazione e a causa della complessità del regolamento che è diverso in ogni fase follicolare. Per studiare i meccanismi di sviluppo del follicolo e le dinamiche dei follicoli durante tutto il ciclo di estro, abbiamo sviluppato un modello di coltura del tessuto ovarico del mouse che può essere usato per osservare lo sviluppo del follicolo tramite un microscopio. Sviluppo sistematico del follicolo, l’ovulazione periodica ed atresia del follicolo può essere riprodotto nel modello dell’ovaia coltivate, e le condizioni della coltura possono essere modulate sperimentalmente. Qui, noi dimostrare l’utilità di questo metodo nello studio dei meccanismi di regolazione dello sviluppo del follicolo e altri fenomeni ovarici.
Introduction
Mouse femminile ovaie contengono parecchie migliaia di follicoli1, e l’ovulazione periodica matura circa dieci ovociti ad ogni ciclo di estro. Follicoli sono classificati in diversi stadi di sviluppo: primordial, primaria, secondaria, antral e follicoli di Graaf, a seconda della forma dello strato cellulare granulosa che circondano ogni ovocita. Maggior parte dei follicoli primordiali sono dormienti, e alcuni di essi sono attivati e crescere in follicoli primari a ogni ciclo di estro2. Dopo la fase follicolare secondaria, sviluppo del follicolo è regolato principalmente da gonadotropine, follicolare di stimolazione dell’ormone (FSH) e luteinizzante (LH). Tuttavia, lo sviluppo del follicolo primordiale e primario è indipendente della gonadotropina e i meccanismi regolatori che governano queste fasi rimangono scarsamente inderstood3,4,5. Oltre ai fattori di crescita e ormoni, il follicolo primordiale e primario è regolato dalle interazioni tra follicoli6,7. Pertanto, abbiamo eseguito le analisi delle dinamiche del follicolo in tessuti di topo dell’ovaia e studiato i meccanismi normativi associati utilizzando colture del tessuto ovarico8,9,10.
Qui, presentiamo due metodi di modello di coltura del tessuto ovarico. Il primo viene utilizzato per analizzare lo sviluppo del follicolo tramite la misura delle aree follicolare, e il secondo è usato per studiare il meccanismo regolatore durante lo sviluppo iniziale di follicolo da primordiale alla fase del follicolo secondario con topi transgenici. Per l’analisi di sviluppo del follicolo, abbiamo usato soprattutto le ovaie di topi femminili 4 – settimana-vecchi perché consentono per una visualizzazione semplice dei follicoli. Per indurre l’ovulazione periodica e modello in vivo lo sviluppo del follicolo, abbiamo riprodotto il picco di LH e osservato l’ovulazione, l’atresia del follicolo e secrezione dell’estradiolo in condizioni di coltura del tessuto. Immagini delle ovaie coltivate furono catturati, e i processi di sviluppo del follicolo sono stati analizzati dai cambiamenti di tracciatura in zona follicolare. Tuttavia, nelle analisi di microscopia del campo luminoso, la distinzione tra follicoli primari primordiale e all’inizio era poco chiara. Così, abbiamo sviluppato un metodo per rilevare piccoli follicoli e distinguere tra la primordiale, primaria, e follicolo secondario in coltivate ovarici tessuti utilizzando Oogenesin1 (Oog1) pro3. 9 e ovaie di topi transgenici R26-H2B-mCherry ai giorni 0 e 4 dopo nascita11. Oog1 espressione è rilevabile negli ovociti dopo l’entrata in meiosi e aumenta gradualmente con lo sviluppo del follicolo, permettendo l’osservazione della transizione da primordial follicoli primari utilizzando immagini time-lapse del tessuto ovario coltivate11 ,12. Anche se i metodi morfologici sono stati utilizzati per studiare i fattori che attivano i follicoli primordiali dormente13,14,15,16, lo sviluppo fisiologico del follicolo nelle ovaie è difficile da osservare, e gli effetti di vari fattori rimangono atipici. Gli attuali metodi di coltura sono stati progettati per affrontare questa scarsità in tempo reale analisi dei fattori di destinazione.
Nello studio presente, abbiamo rintracciato lo sviluppo follicolare, utilizzando un metodo di imaging time-lapse e caratterizzato il processo di sviluppo del follicolo. I nostri metodi innovativi offrono uno strumento senza precedenti per studiare la fisiologia delle ovaie.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo studio, abbiamo sviluppato due nuovi metodi per studiare lo sviluppo del follicolo nelle ovaie del mouse. Il primo metodo comporta la cultura dei tessuti di topi adulti ovarico affettato seguita da analisi dello sviluppo del follicolo, e il secondo prevede l’utilizzo di time-lapse imaging per visualizzare lo sviluppo iniziale del follicolo durante la fase di gonadotropina-indipendente. In precedenza, abbiamo usato il presente metodo di coltura del tessuto ovario per valutare l’effetto di fattore inibitorio di l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Dr. Naojiro Minami (Kyoto University) per fornire i topi Oog1pro3.9 . Questa ricerca è stata sostenuta da JSP (KAKENHI # JP15H06275) e la Fondazione di Nitto.
Materials
| Follicle stimulating hormone from human pituitary | SIGMA | F4021 | |
| Lutenizing hormone from equine pituitary | SIGMA | L9773 | |
| Penicillin-streptomycin solution | Wako Pure Chemical Industries | 168-23191 | |
| MEM a, GlutaMax, no nucleotides | Thermo Fisher | 32561037 | |
| Glass bottom dish | MatTek | P35G-0-10-C | 35mm dish, No. 0 coverslip, 10mm glass diameter |
| Millicell cell culture insert | Merck Millipore | PICM0RG50 | Diameter: 315 mm, pore size: 0.4 mm, material: hydrophilic PTTE |
| 3.5cm cell culture dishes | greiner bio-one | 627160 | |
| 50ml / centrifuge tube with triple seal cap | IWAKI | 2345-050 | |
| Low-profile disposable blades 819 | Leica | 14035838925 | |
| LSM 710 | Carl Zeiss | Confocal microscope | |
| CellVoyager, CV1000 | Yokogawa Electric Corporation | Time-lapse imaging | |
| BZ-X700 | KEYENCE | Time-lapse imaging |
References
- Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G., Ebling, F. J., Kerr, J. B. Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary. Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).
- Adams, G. P., Jaiswal, R., Singh, J., Malhi, P. Progress in understanding ovarian follicular dynamics in cattle. Theriogenology. 69 (1), 72-80 (2008).
- Palma, G. A., et al. Biology and biotechnology of follicle development. Sci World J. , (2012).
- Knight, P. G., Glister, C. TGF-beta superfamily members and ovarian follicle development. Reproduction. 132 (2), 191-206 (2006).
- Picton, H. M., Harris, S. E., Muruvi, W., Chambers, E. L. The in vitro growth and maturation of follicles. Reproduction. 136 (6), 703-715 (2008).
- Spears, N., de Bruin, J. P., Gosden, R. G. The establishment of follicular dominance in co-cultured mouse ovarian follicles. J Reprod Fertil. 106 (1), 1-6 (1996).
- Baker, S. J., Srsen, V., Lapping, R., Spears, N. Combined effect of follicle-follicle interactions and declining follicle-stimulating hormone on murine follicle health in vitro. Biol Reprod. 65 (4), 1304-1310 (2001).
- Komatsu, K., et al. Analysis of the Effect of Leukemia Inhibitory Factor on Follicular Growth in Cultured Murine Ovarian Tissue. Biol Reprod. 93 (1), 18 (2015).
- Komatsu, K., Masubuchi, S. The concentration-dependent effect of progesterone on follicle growth in the mouse ovary. J Reprod Dev. 63 (3), 271-277 (2017).
- Murase, T., et al. Follicle dynamics: visualization and analysis of follicle growth and maturation using murine ovarian tissue culture. J Assist Reprod Genet. , 1-5 (2017).
- Ishida, M., et al. The promoter of the oocyte-specific gene, Oog1, functions in both male and female meiotic germ cells in transgenic mice. PLoS One. 8 (7), 68686 (2013).
- Minami, N., et al. Oogenesin is a novel mouse protein expressed in oocytes and early cleavage-stage embryos. Biol Reprod. 69 (5), 1736-1742 (2003).
- Nilsson, E. E., Skinner, M. K. Growth and differentiation factor-9 stimulates progression of early primary but not primordial rat ovarian follicle development. Biol Reprod. 67 (3), 1018-1024 (2002).
- Nilsson, E. E., Kezele, P., Skinner, M. K. Leukemia inhibitory factor (LIF) promotes the primordial to primary follicle transition in rat ovaries. Mol Cell Endocrinol. 188 (1-2), 65-73 (2002).
- Nilsson, E. E., Skinner, M. K. Bone morphogenetic protein-4 acts as an ovarian follicle survival factor and promotes primordial follicle development. Biol Reprod. 69 (4), 1265-1272 (2003).
- Nilsson, E. E., Skinner, M. K. Kit ligand and basic fibroblast growth factor interactions in the induction of ovarian primordial to primary follicle transition. Mol Cell Endocrinol. 214 (1-2), 19-25 (2004).
- Abe, T., et al. Establishment of conditional reporter mouse lines at ROSA26 locus for live cell imaging. Genesis. 49 (7), 579-590 (2011).
- Lan, Z. J., Xu, X., Cooney, A. J. Differential oocyte-specific expression of Cre recombinase activity in GDF-9-iCre, Zp3cre, and Msx2Cre transgenic mice. Biol Reprod. 71 (5), 1469-1474 (2004).
- Payer, B., et al. Generation of stella-GFP transgenic mice: a novel tool to study germ cell development. Genesis. 44 (2), 75-83 (2006).
- Ohinata, Y., Sano, M., Shigeta, M., Yamanaka, K., Saitou, M. A comprehensive, non-invasive visualization of primordial germ cell development in mice by the Prdm1-mVenus and Dppa3-ECFP double transgenic reporter. Reproduction. 136 (4), 503-514 (2008).
