Cultivo de tejido ovárico para visualizar fenómenos en ovario de ratón
Summary
Cultivos de tejido ováricos se puede utilizar como modelos de la atresia de desarrollo, la ovulación y el folículo folículo e indicar mecanismos reguladores de procesos dinámicos de ovarianos.
Abstract
Las hembras mamíferas ovulan periódicamente una cantidad casi constante de ovocitos durante cada ciclo estral. Para sostener tal regularidad y periodicidad, regulación ocurre a nivel de eje hipotalámico-pituitario-gonadal y en el desarrollo de los folículos en el ovario. A pesar de estudios activos, mecanismos de desarrollo del folículo no son claros debido a los varios pasos de la activación del folículo primordial inactiva a la ovulación y debido a la complejidad de la regulación que difiere en cada fase folicular. Para investigar los mecanismos de desarrollo folicular y la dinámica de los folículos durante el ciclo estral, se desarrolló un modelo de cultura de tejido ovárico de ratón que puede ser utilizado para observar el desarrollo folicular utilizando un microscopio. Desarrollo sistemático del folículo, la ovulación periódica y atresia del folículo pueden todas reproducidas en el modelo de ovario cultivadas, y las condiciones de cultivo pueden ser moduladas experimentalmente. Aquí, demostramos la utilidad de este método en el estudio de los mecanismos de regulación del desarrollo folicular y otros fenómenos de ovarianos.
Introduction
Los ovarios de la hembra del ratón contienen varios mil folículos1, y la ovulación periódica madura aproximadamente diez ovocitos en cada ciclo estral. Los folículos se clasifican en varias etapas del desarrollo: primordial, primaria, secundaria, antral y los folículos de Graaf, dependiendo de la forma de la capa celular granulosa que rodean a cada ovocito. La mayoría de los folículos primordiales están inactivos, y algunos de ellos se activan y se convierten en folículos primarios en cada estro ciclo2. Después de la etapa folicular secundaria, desarrollo folicular está regulado principalmente por gonadotropinas, foliculares estimulante hormona (FSH) y hormona luteinizante (LH). Sin embargo, desarrollo del folículo primordial y principal es independiente de la gonadotropina, y los mecanismos de regulación que rigen estas etapas siguen siendo mal inderstood3,4,5. Además de factores de crecimiento y hormonas, el folículo primordial y primario está regulado por las interacciones entre los folículos de6,7. Por lo tanto, se realizaron análisis de la dinámica folicular en los tejidos de ovario de ratón e investigaron los mecanismos de regulación asociados con cultivos de tejido ovárico8,9,10.
Adjunto, presentamos dos métodos del modelo de cultivo de tejido ovárico. El primero se utiliza para analizar el desarrollo del folículo por la medida de áreas foliculares, y la segunda se utiliza para estudiar el mecanismo de regulación durante el desarrollo temprano del folículo de primordial a la etapa de folículo secundario con ratones transgénicos. Para el análisis del desarrollo del folículo, utilizan principalmente ovarios de ratones hembra 4 – semanas de edad debido a que permiten la fácil visualización de los folículos. Para inducir la ovulación periódica y desarrollo de modelos en vivo del folículo, reproducen de LH y la ovulación observada, la atresia del folículo y secreción de estradiol bajo condiciones de cultivo de tejidos. Imágenes de los ovarios cultivados fueron capturados, y los procesos de desarrollo del folículo se analizaron por los cambios de trazado en la zona folicular. Sin embargo, en los análisis de microscopía de campo claro, la distinción entre folículos primordiales y principios primarios era claro. Así, se desarrolló un método para detectar folículos pequeños y distinguir entre el primordial, primario, y folículo secundario en cultiva tejidos ováricos usando Oogenesin1 pro3 (Oog1). 9 y R26-H2B-mCherry ovarios de ratones transgénicos a los 0 y 4 días después del nacimiento11. Oog1 expresión es detectable en ovocitos después de entrada en meiosis y aumenta gradualmente con el desarrollo del folículo, lo que permite la observación de la transición de primordial a primarios folículos con imágenes de Time-lapse de tejido de ovario cultivadas11 ,12. Aunque se han utilizado métodos morfológicos para estudiar factores que activan los folículos primordiales inactivos13,14,15,16, desarrollo fisiológico del folículo en los ovarios es difícil de observar, y los efectos de varios factores siendo desacostumbrados. Los métodos actuales de la cultura fueron diseñados para abordar esta falta en tiempo real Análisis de factores objetivos.
En el presente estudio, con desarrollo folicular utilizando un método de imagen Time-lapse y había caracterizado el proceso de desarrollo folicular. Nuestros nuevos métodos ofrecen una herramienta sin precedentes para la investigación de la fisiología de los ovarios.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este estudio, hemos desarrollado dos nuevos métodos para estudiar el desarrollo folicular en ovarios de ratón. El primer método implica el cultivo de los tejidos de ratones adultos ovárico en rodajas seguida por análisis del desarrollo del folículo, y el segundo involucra el uso de Time-lapse de imágenes para visualizar el desarrollo folicular temprano durante la etapa independiente de la gonadotropina. Anteriormente, utiliza el método de cultivo de tejidos de ovario presente para evaluar el efecto del factor …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Dr. Naojiro Minami (Universidad de Kioto) para proporcionar los ratones Oog1pro3.9 . Esta investigación fue apoyada por el JSP (KAKENHI # JP15H06275) y la Fundación de Nitto.
Materials
| Follicle stimulating hormone from human pituitary | SIGMA | F4021 | |
| Lutenizing hormone from equine pituitary | SIGMA | L9773 | |
| Penicillin-streptomycin solution | Wako Pure Chemical Industries | 168-23191 | |
| MEM a, GlutaMax, no nucleotides | Thermo Fisher | 32561037 | |
| Glass bottom dish | MatTek | P35G-0-10-C | 35mm dish, No. 0 coverslip, 10mm glass diameter |
| Millicell cell culture insert | Merck Millipore | PICM0RG50 | Diameter: 315 mm, pore size: 0.4 mm, material: hydrophilic PTTE |
| 3.5cm cell culture dishes | greiner bio-one | 627160 | |
| 50ml / centrifuge tube with triple seal cap | IWAKI | 2345-050 | |
| Low-profile disposable blades 819 | Leica | 14035838925 | |
| LSM 710 | Carl Zeiss | Confocal microscope | |
| CellVoyager, CV1000 | Yokogawa Electric Corporation | Time-lapse imaging | |
| BZ-X700 | KEYENCE | Time-lapse imaging |
References
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