مقارنة عالية الاستبانة للترددات الاقتران البكتيري
Summary
بهدف فهم السلوكيات عناصر الحمض النووي كونجوجاتيفي البكتيرية المختلفة تحت ظروف مختلفة، يمكننا وصف بروتوكول للكشف عن الاختلافات في تكرار الاقتران، بدقة عالية، لتقدير مدى فعالية هذه البكتيريا المانحين يبدأ الاقتران.
Abstract
تصريف الجرثومي خطوة هامة في نقل جينات مقاومة المضادات الحيوية أفقياً عبر عنصر الحمض النووي كونجوجاتيفي. مقارنات معمقة للتردد التصريف تحت ظروف مختلفة مطلوبة لفهم كيف ينتشر العنصر كونجوجاتيفي في الطبيعة. ومع ذلك، الأساليب التقليدية لمقارنة تواتر الاقتران غير مناسبة لمقارنات معمقة بسبب الخلفية العالية الناجمة عن وقوع أحداث اقتران إضافية على لوحة انتقائية. خفضنا الخلفية بنجاح بإدخال أسلوب (MPN) عدد الأكثر احتمالاً وتركيز أعلى من المضادات الحيوية لمنع المزيد من التصريف في المتوسط السائل انتقائية. وبالإضافة إلى ذلك، علينا وضع بروتوكول لتقدير احتمال كيف غالباً ما المانحة الخلايا الشروع الاقتران بفرز الخلايا مانح واحد ضمن تجمعات المستلم بالأسفار تنشيط الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية). استخدام البلازميدات اثنين، pBP136 و pCAR1، الاختلافات في تكرار الاقتران في الخلايا Pseudomonas putida يمكن اكتشاف في المتوسطة السائل بنسب مختلفة من إثارة. ترددات الشروع في تصريف كانت أعلى بالنسبة pBP136 من أجل pCAR1. باستخدام هذه النتائج، يمكننا أن نفهم أفضل الميزات التصريف في هذه البلازميدات اثنين.
Introduction
تصريف البكتيرية من عناصر وراثية متحركة، البلازميدات كونجوجاتيفي، والعناصر التكاملية وكونجوجاتيفي (ICEs) مهم للانتشار الأفقي للمعلومات الوراثية. ويمكن تعزيز التطور الجرثومي السريع والتكيف ويحيل مقاومة عصيات الجينات1،2. يمكن أن تتأثر تكرار الاقتران بالبروتينات المشفرة في العناصر كونجوجاتيفي لتعبئة “الحمض النووي” (الغوغاء) وتكوين زوج التزاوج (MPF)، بما في ذلك الجنس بيلي، التي تصنف وفقا للغوغاء و MPF نوع3،4، 5. يمكن أن يتأثر أيضا بالجهات المانحة والمتلقية زوج6 وظروف النمو7،الخلايا8،10،9،،من11(12 معدل النمو وكثافة الخلية، سطح صلب أو سائل المتوسطة، درجة الحرارة، توافر المغذيات ووجود الاتصالات). لفهم كيفية انتشار عناصر كونجوجاتيفي بين البكتيريا، من الضروري مقارنة تواتر الاقتران بالتفصيل.
تكرار الاقتران بين البلدان المانحة والمتلقية من أزواج بعد التزاوج تقدر عادة بالطرق التقليدية كما يلي. (ط) أولاً، يتم احتساب عدد المستعمرات الجهات المانحة والمتلقية؛ (ثانيا)، ثم يتم عد المستعمرات المستفيدة، التي تلقت عناصر كونجوجاتيفي (= ترانسكونجوجانتس)؛ (ثالثا) وأخيراً، يحسب تكرار الاقتران بتقسيم مستعمرة تشكيل وحدات (زيمبابوي) ترانسكونجوجانتس تلك الجهات المانحة و/أو مستلم13. ومع ذلك، عند استخدام هذا الأسلوب، الخلفية مرتفعة بسبب اقتران إضافية الأحداث التي يمكن أن تحدث أيضا على لوحات انتقائية تستخدم للحصول على ترانسكونجوجانتس عند كثافة الخلية هو ارتفاع10. ولذلك، من الصعب الكشف عن الفروق الصغيرة في التردد (أقل من فارق الوقت). نحن قدم مؤخرا طريقة (MPN) رقم الأكثر احتمالاً استخدام سائل المتوسطة التي تحتوي على تركيز أعلى من المضادات الحيوية. هذا الأسلوب خفض الخلفية عن طريق تثبيط زيادة التصريف في المتوسط انتقائية؛ وهكذا يمكن تقدير تواتر الاقتران مع دقة أعلى.
التصريف يمكن تقسيمها إلى ثلاث خطوات: (1) مرفق المانح ومتلق الزوج (2) الشروع في نقل كونجوجاتيفي، و (3) الانفصال من زوج14. خلال الخطوات (1) و (3)، وهناك تفاعل المادية بين البلدان المانحة والمتلقية من الخلايا؛ وهكذا، كثافة الخلية والظروف البيئية يمكن أن تؤثر هذه الخطوات، على الرغم من أن ملامح بيلي الجنس أيضا هامة. الخطوة (2) يرجح أن ينظم عدة الجينات المشاركة في تصريف استجابة للتغيرات الخارجية، التي يمكن أن تتأثر بالعديد من الميزات بلازميد، الجهات المانحة والمتلقية. على الرغم من أن المرفق المادي أو مفرزة من أزواج بين المانحين والمتلقين يمكن حسابياً محاكاة استخدام تقدير خلايا كجسيمات، وينبغي قياس تكرار الخطوة (2) تجريبيا. كانت هناك بضعة تقارير عن الملاحظات المباشرة كيف غالباً المانحين يمكن الشروع في تصريف [الخطوة (2)] استخدام fluorescence مجهرية15،16؛ ومع ذلك، هذه الأساليب لا الفائق لأنه يجب رصد عدد كبير من الخلايا. ولذلك، قمنا بتطوير أسلوب جديد لتقدير احتمال حدوث الخطوة (2) باستخدام fluorescence تنشيط الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية). لدينا طريقة يمكن تطبيقها على أي بلازميد، دون تحديد الجينات الأساسية للاقتران.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، نحن نقدم بروتوكول عالية الدقة للكشف عن الاختلافات في وتيرة التصريف تحت ظروف مختلفة، باستخدام أسلوب MPN لتقدير عدد ترانسكونجوجانتس. إحدى الخطوات الهامة في البروتوكول هو إضعاف الخليط من الجهات المانحة والمتلقية بعد التزاوج حتى لا ترانسكونجوجانتس تنمو. يتم إضافة خطوة أخرى تركيزات عالي?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر الدكتور ك. كاماتشي من “المعهد الوطني للأمراض المعدية” (اليابان) لتوفير pBP136 والأستاذ الدكتور H. نجيري من جامعة طوكيو (اليابان) لتوفير pCAR1. ونحن ممتنون أيضا للأستاذ الدكتور مولين Sølen من “جامعة الدنمارك التقنية” لتقديم pJBA28. أيد هذا العمل كاكينهي JSPS (أرقام المنح 15 ح 05618 و 15KK0278) لمرض التصلب العصبي المتعدد (https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15H05618/، https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15KK0278/).
Materials
| MoFlo XDP | Beckman-Coulter | ML99030 | FACS |
| IsoFlow | Beckman-Coulter | 8599600 | Sheath solution |
| Fluorospheres (10 μm) | Beckman-Coulter | 6605359 | beads to set up the FACS |
| Incubator | Yamato Scientific Co. Ltd | 211197-IC802 | |
| UV-VIS Spectrophotometer UV-1800 | SIMADZU Corporation | UV-1800 | |
| 96-well plates | NIPPON Genetics Co, Ltd | TR5003 | |
| microplate type Petri dish | AXEL | 1-9668-01 | for validation of sorting |
| membrane filter | ADVANTEC | C045A025A | for filter mating |
| pippettes | Nichiryo CO. Ltd | 00-NPX2-20, 00-NPX2-200, 00-NPX2-1000 |
0.5-10 μL, 20-200 μL, 100-1000 μL |
| multi-channel pippetes | Nichiryo CO. Ltd | 00-NPM-8VP, 00-NPM-8LP |
0.5-10 μL, 20-200 μL |
| Tryptone | BD Difco | 211705 | |
| Yeast extract | BD Difco | 212750 | |
| NaCl | Sigma | S-5886 | |
| Agar | Nakarai tesque | 01162-15 | |
| rifampicin | Wako | 185-01003 | |
| gentamicin | Wako | 077-02974 | |
| kanamycin | Wako | 115-00342 | |
| Petri dish | AXEL | 3-1491-51 | JPND90-15 |
| microtubes | Fukaekasei | 131-815C | |
| 500 mL disposable spinner flask | Corning | CLS3578 |
References
- Cabezon, E., Ripoll-Rozada, J., Pena, A., de la Cruz, F., Arechaga, I. Towards an integrated model of bacterial conjugation. FEMS Microbiology Reviews. 39 (1), 81-95 (2015).
- Johnson, C. M., Grossman, A. D. Integrative and conjugative elements (ICEs): what they do and how they work. Annual Review of Genetics. 49, 577-601 (2015).
- Garcillán-Barcia, M. P., Alvarado, A., de la Cruz, F. Identification of bacterial plasmids based on mobility and plasmid population biology. FEMS Microbiology Reviews. 35 (5), 936-956 (2011).
- Smillie, C., Garcillán-Barcia, M. P., Francia, M. V., Rocha, E. P., de la Cruz, F. Mobility of plasmids. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74 (3), 434-452 (2010).
- Garcillán-Barcia, M. P., Francia, M. V., de la Cruz, F. The diversity of conjugative relaxases and its application in plasmid classification. FEMS Microbiology Reviews. 33 (3), 657-687 (2009).
- Shintani, M., et al. Recipient range of IncP-7 conjugative plasmid pCAR2 from Pseudomonas putida HS01 is broader than from other Pseudomonas strains. Biotechnology Letters. 27 (23-24), 1847-1853 (2005).
- Yanagida, K., et al. Comparisons of the transferability of plasmids pCAR1, pB10, R388, and NAH7 among Pseudomonas putida at different cell densities. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 80 (5), 1020-1023 (2016).
- Schuurmans, J. M., et al. Effect of growth rate and selection pressure on rates of transfer of an antibiotic resistance plasmid between E. coli strains. Plasmid. 72, 1-8 (2014).
- Bradley, D. E., Taylor, D. E., Cohen, D. R. Specification of surface mating systems among conjugative drug resistance plasmids in Escherichia coli K-12. Journal of Bacteriology. 143 (3), 1466-1470 (1980).
- Nakazawa, S., et al. Different transferability of incompatibility (Inc) P-7 plasmid pCAR1 and IncP-1 plasmid pBP136 in stirring liquid conditions. PLoS One. 12 (10), e0186248 (2017).
- Verma, T., Ramteke, P. W., Garg, S. K. Effect of ecological factors on conjugal transfer of chromium-resistant plasmid in Escherichia coli isolated from tannery effluent. Biotechnology and Applied Biochemistry. 102 (1-6), 5-20 (2002).
- Sakuda, A., et al. Divalent cations increase the conjugation efficiency of the incompatibility P-7 group plasmid pCAR1 among different Pseudomonas hosts. Microbiology. 164 (1), 20-27 (2018).
- Corliss, T. L., Cohen, P. S., Cabelli, V. J. R-plasmid transfer to and from Escherichia coli strains Isolated from human fecal samples. Applied and Environmental Microbiology. 41 (4), 959-966 (1981).
- Zhong, X., Krol, J. E., Top, E. M., Krone, S. M. Accounting for mating pair formation in plasmid population dynamics. Journal of Theoretical Biology. 262 (4), 711-719 (2010).
- Gilmour, M. W., Lawley, T. D., Taylor, D. E. The cytology of bacterial conjugation. EcoSal Plus. 2004, (2004).
- Minoia, M., et al. Stochasticity and bistability in horizontal transfer control of a genomic island in Pseudomonas. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (52), 20792-20797 (2008).
- Kamachi, K., et al. Plasmid pBP136 from Bordetella pertussis represents an ancestral form of IncP-1beta plasmids without accessory mobile elements. Microbiology. 152 (12), 3477-3484 (2006).
- Simon, R., Priefer, U., Pühler, A. A broad host range mobilization system for in vivo genetic engineering: transposon mutagenesis in gram negative bacteria. Nature Biotechnology. 1 (9), 784-791 (1983).
- Andersen, J. B., et al. New unstable variants of green fluorescent protein for studies of transient gene expression in bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 64 (6), 2240-2246 (1998).
- Shintani, M., et al. Characterization of the replication, maintenance, and transfer features of the IncP-7 plasmid pCAR1, which carries genes involved in carbazole and dioxin degradation. Applied and Environmental Microbiology. 72 (5), 3206-3216 (2006).
- Shintani, M., et al. Single-cell analyses revealed transfer ranges of IncP-1, IncP-7, and IncP-9 plasmids in a soil bacterial community. Applied and Environmental Microbiology. 80 (1), 138-145 (2014).
- Jarvis, B., Wilrich, C., Wilrich, P. T. Reconsideration of the derivation of most probable numbers, their standard deviations, confidence bounds and rarity values. Journal of Applied Microbiology. 109 (5), 1660-1667 (2010).
- Haagensen, J. A., Hansen, S. K., Johansen, T., Molin, S. In situ detection of horizontal transfer of mobile genetic elements. FEMS Microbiology Ecology. 42 (2), 261-268 (2002).
- Herrero, M., de Lorenzo, V., Timmis, K. N. Transposon vectors containing non-antibiotic resistance selection markers for cloning and stable chromosomal insertion of foreign genes in gram-negative bacteria. Journal of Bacteriology. 172 (11), 6557-6567 (1990).
- Bagdasarian, M., et al. Specific-purpose plasmid cloning vectors. II. Broad host range, high copy number, RSF1010-derived vectors, and a host-vector system for gene cloning in Pseudomonas. Gene. 16 (1-3), 237-247 (1981).
- Maeda, K., et al. Complete nucleotide sequence of carbazole/dioxin-degrading plasmid pCAR1 in Pseudomonas resinovorans strain CA10 indicates its mosaicity and the presence of large catabolic transposon Tn4676. Journal of Molecular Biology. 326 (1), 21-33 (2003).
- Takahashi, Y., Shintani, M., Yamane, H., Nojiri, H. The complete nucleotide sequence of pCAR2: pCAR2 and pCAR1 were structurally identical IncP-7 carbazole degradative plasmids. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 73 (3), 744-746 (2009).
