Bakteriyel konjugasyon frekans yüksek çözünürlüklü karşılaştırma
Summary
Bir amaçla çeşitli bakteri Konjügatif DNA öğeleri farklı koşullar altında davranışlarını anlamak için biz nasıl verimli bir şekilde tahmin etmek için yüksek çözünürlüklü konjugasyon frekans farklılıkları algılamak için bir protokol tarif donör bakteri konjugasyon başlatır.
Abstract
Bakteriyel konjugasyon antibiyotik direnç genleri yatay havalesi yoluyla Konjügatif bir DNA öğesi içinde önemli bir adımdır. Ayrıntılı karşılaştırmalar konjugasyon frekans farklı koşullar altında nasıl Konjügatif öğesi doğada yayılır anlamak için gereklidir. Ancak, konjugasyon frekans karşılaştırmak için geleneksel yöntemler, seçici plaka üzerinde ek fiil olayların neden yüksek arka plan nedeniyle ayrıntılı karşılaştırmalar için uygun değildir. Başarılı bir şekilde arka planda en olası bir numara (MPN) yöntemi ve yoğun daha fazla konjugasyon selektif sıvı ortamda önlemek için antibiyotik tanıtarak azaltılmış. Buna ek olarak, sık sık nasıl olasılığını tahmin etmek için bir protokol donör hücreleri başlatmak konjugasyon floresans aktif hücre (FACS) sıralama alıcı havuzlarında tek donör hücreleri sıralayarak geliştirdik. İki plazmid kullanarak, pBP136 ve pCAR1, Pseudomonas putida hücreleri konjugasyon sıklıkla farklılıkları farklı heyecan verici fiyatlara sıvı ortamda tespit edilemedi. Konjugasyon inisiyasyon frekanslar için pCAR1 için pBP136 yüksekti. Bu sonuçları kullanarak, biz daha iyi bu iki plazmid konjugasyon özelliklerinde anlayabiliyorum.
Introduction
Mobil genetik öğeleri, Konjügatif plazmid ve bütünleştirici ve Konjügatif öğeleri (ICES) bakteriyel konjugasyon genetik bilgi yatay yaymak için önemlidir. Bu hızlı bakteri evriminin ve adaptasyon teşvik ve tedavisine direnç genleri1,2iletmek. Konjugasyon frekans mafya ve MPF tip3,4göregizli seks pili de dahil olmak üzere proteinler DNA ‘ (çete) and çiftleşme çifti oluşumu (MPF), hareketlilik için Konjügatif öğeler üzerinde kodlanmış etkilenebilir, 5. Donör ve alıcı çift6 ve hücre7,8,9,10,11,12 (büyüme şartları tarafından da etkilenebilir büyüme oranı, hücre yoğunluğu, katı yüzey veya sıvı orta, sıcaklık, besin kullanılabilirlik ve katyonlar varlığı). Nasıl Konjügatif öğeleri bakteriler arasında yayılır anlamak için konjugasyon frekans ayrıntılı olarak karşılaştırmak gereklidir.
Donör ve çiftleşme sonra alıcı çiftleri arasında konjugasyon frekans genellikle tahmin edilmektedir geleneksel yöntemlerle aşağıdaki gibi. (i) ilk olarak, donör ve alıcı kolonileri sayılar dikkate alınır; (ii) sonra (transconjugants =) Konjügatif öğeleri alınan alıcı koloniler sayılır; (III) ve son olarak, konjugasyon Frekans birimleri (CFU) transconjugants oluşturan colony Bu donör ve/veya alıcı13göre bölünerek hesaplanır. Ancak, bu yöntemi kullanırken, arka plan hücre yoğunluğu yüksek10olduğunda transconjugants elde etmek için kullanılan seçici tabaklarda alınamayabilir ek fiil olaylar nedeniyle yüksektir. Bu nedenle, frekans (aşağıda bir 10 kat fark) küçük farklılıkları tespit etmek zordur. Biz son zamanlarda yoğun antibiyotik içeren sıvı orta kullanarak en olası numara (MPN) yöntemi tanıttı. Bu yöntem daha fazla seçici ortamda konjugasyon engelleyerek arka azalır; Böylece, daha yüksek çözünürlük ile konjugasyon frekans tahmin edilebilir.
Konjugasyon üç adım ayrılabilir: Eki (1) verici alıcının çifti (2) Konjügatif transfer inisiyasyon ve ayrılma (3) çift14. Adımları (1) ve (3) sırasında donör ve alıcı hücreler arasındaki fiziksel etkileşim olduğunu; Böylece, eğitimdir, aynı zamanda seks pili özelliklerinden önemli hücre yoğunluğu ve çevre koşulları aşağıdaki adımları etkileyebilir. Adım (2) büyük olasılıkla birkaç genler konjugasyon plazmid, donör ve alıcı çeşitli özellikleri tarafından etkilenebilir dış değişiklikler karşısında yer alan ifade tarafından düzenlenmiştir. Her ne kadar fiziksel ek veya dekolmanı verici-alıcı çiftlerinin matematiksel bir tahmini hücre tanecik olarak kullanarak benzetimi yapılabilir, adım (2) sıklığı deneysel olarak ölçülmelidir. Orada-si olmak be birkaç raporları nasıl doğrudan gözlemleri kez bağış başlatmak floresans mikroskobu15,16; kullanarak konjugasyon [adım (2)] çok sayıda hücre izlenmesi gerekir çünkü ancak, bu yöntemleri yüksek üretilen iş değildir. Bu nedenle, floresans aktif hücre (FACS) sıralama kullanarak adım (2) geçtiği olasılığını tahmin etmek için yeni bir yöntem geliştirdik. Bizim Yöntem konjugasyon için gerekli genler tanımlaması olmadan herhangi bir plazmid uygulanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, farklı koşullarda konjugasyon frekans farklılıkları algılamak için yüksek çözünürlüklü bir protokol transconjugants sayısını tahmin etmek için bir MPN yöntemi kullanarak mevcut. Bir önemli adım protokolündeki donör ve alıcı karışımı yok transconjugants büyümek kadar çiftleşmeden sonra erkeğini sulandrarak. Bir adım daha yüksek konsantrasyonda antibiyotik daha fazla konjugasyon önlemek için selektif sıvı orta olarak ekliyor. Bu yordamları Seçmeli Orta daha fazla konjugasyo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. K. Kamachi, Ulusal Enstitüsü, bulaşıcı hastalıklar (Japonya) pBP136 ve Prof. Dr. H. Nojiri Tokyo Üniversitesi (Japonya) pCAR1 sağlamak için verdiğiniz için teşekkür ederiz. Ayrıca pJBA28 sağlamak için Danimarka Teknik Üniversitesi Profesör Doktor Molin Sølen için minnettarız. Bu eser JSP’ler KAKENHI tarafından desteklenmiştir (Grant sayıları 15H 05618 ve 15KK0278) MS (https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15H05618/, https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15KK0278/).
Materials
| MoFlo XDP | Beckman-Coulter | ML99030 | FACS |
| IsoFlow | Beckman-Coulter | 8599600 | Sheath solution |
| Fluorospheres (10 μm) | Beckman-Coulter | 6605359 | beads to set up the FACS |
| Incubator | Yamato Scientific Co. Ltd | 211197-IC802 | |
| UV-VIS Spectrophotometer UV-1800 | SIMADZU Corporation | UV-1800 | |
| 96-well plates | NIPPON Genetics Co, Ltd | TR5003 | |
| microplate type Petri dish | AXEL | 1-9668-01 | for validation of sorting |
| membrane filter | ADVANTEC | C045A025A | for filter mating |
| pippettes | Nichiryo CO. Ltd | 00-NPX2-20, 00-NPX2-200, 00-NPX2-1000 |
0.5-10 μL, 20-200 μL, 100-1000 μL |
| multi-channel pippetes | Nichiryo CO. Ltd | 00-NPM-8VP, 00-NPM-8LP |
0.5-10 μL, 20-200 μL |
| Tryptone | BD Difco | 211705 | |
| Yeast extract | BD Difco | 212750 | |
| NaCl | Sigma | S-5886 | |
| Agar | Nakarai tesque | 01162-15 | |
| rifampicin | Wako | 185-01003 | |
| gentamicin | Wako | 077-02974 | |
| kanamycin | Wako | 115-00342 | |
| Petri dish | AXEL | 3-1491-51 | JPND90-15 |
| microtubes | Fukaekasei | 131-815C | |
| 500 mL disposable spinner flask | Corning | CLS3578 |
References
- Cabezon, E., Ripoll-Rozada, J., Pena, A., de la Cruz, F., Arechaga, I. Towards an integrated model of bacterial conjugation. FEMS Microbiology Reviews. 39 (1), 81-95 (2015).
- Johnson, C. M., Grossman, A. D. Integrative and conjugative elements (ICEs): what they do and how they work. Annual Review of Genetics. 49, 577-601 (2015).
- Garcillán-Barcia, M. P., Alvarado, A., de la Cruz, F. Identification of bacterial plasmids based on mobility and plasmid population biology. FEMS Microbiology Reviews. 35 (5), 936-956 (2011).
- Smillie, C., Garcillán-Barcia, M. P., Francia, M. V., Rocha, E. P., de la Cruz, F. Mobility of plasmids. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74 (3), 434-452 (2010).
- Garcillán-Barcia, M. P., Francia, M. V., de la Cruz, F. The diversity of conjugative relaxases and its application in plasmid classification. FEMS Microbiology Reviews. 33 (3), 657-687 (2009).
- Shintani, M., et al. Recipient range of IncP-7 conjugative plasmid pCAR2 from Pseudomonas putida HS01 is broader than from other Pseudomonas strains. Biotechnology Letters. 27 (23-24), 1847-1853 (2005).
- Yanagida, K., et al. Comparisons of the transferability of plasmids pCAR1, pB10, R388, and NAH7 among Pseudomonas putida at different cell densities. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 80 (5), 1020-1023 (2016).
- Schuurmans, J. M., et al. Effect of growth rate and selection pressure on rates of transfer of an antibiotic resistance plasmid between E. coli strains. Plasmid. 72, 1-8 (2014).
- Bradley, D. E., Taylor, D. E., Cohen, D. R. Specification of surface mating systems among conjugative drug resistance plasmids in Escherichia coli K-12. Journal of Bacteriology. 143 (3), 1466-1470 (1980).
- Nakazawa, S., et al. Different transferability of incompatibility (Inc) P-7 plasmid pCAR1 and IncP-1 plasmid pBP136 in stirring liquid conditions. PLoS One. 12 (10), e0186248 (2017).
- Verma, T., Ramteke, P. W., Garg, S. K. Effect of ecological factors on conjugal transfer of chromium-resistant plasmid in Escherichia coli isolated from tannery effluent. Biotechnology and Applied Biochemistry. 102 (1-6), 5-20 (2002).
- Sakuda, A., et al. Divalent cations increase the conjugation efficiency of the incompatibility P-7 group plasmid pCAR1 among different Pseudomonas hosts. Microbiology. 164 (1), 20-27 (2018).
- Corliss, T. L., Cohen, P. S., Cabelli, V. J. R-plasmid transfer to and from Escherichia coli strains Isolated from human fecal samples. Applied and Environmental Microbiology. 41 (4), 959-966 (1981).
- Zhong, X., Krol, J. E., Top, E. M., Krone, S. M. Accounting for mating pair formation in plasmid population dynamics. Journal of Theoretical Biology. 262 (4), 711-719 (2010).
- Gilmour, M. W., Lawley, T. D., Taylor, D. E. The cytology of bacterial conjugation. EcoSal Plus. 2004, (2004).
- Minoia, M., et al. Stochasticity and bistability in horizontal transfer control of a genomic island in Pseudomonas. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (52), 20792-20797 (2008).
- Kamachi, K., et al. Plasmid pBP136 from Bordetella pertussis represents an ancestral form of IncP-1beta plasmids without accessory mobile elements. Microbiology. 152 (12), 3477-3484 (2006).
- Simon, R., Priefer, U., Pühler, A. A broad host range mobilization system for in vivo genetic engineering: transposon mutagenesis in gram negative bacteria. Nature Biotechnology. 1 (9), 784-791 (1983).
- Andersen, J. B., et al. New unstable variants of green fluorescent protein for studies of transient gene expression in bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 64 (6), 2240-2246 (1998).
- Shintani, M., et al. Characterization of the replication, maintenance, and transfer features of the IncP-7 plasmid pCAR1, which carries genes involved in carbazole and dioxin degradation. Applied and Environmental Microbiology. 72 (5), 3206-3216 (2006).
- Shintani, M., et al. Single-cell analyses revealed transfer ranges of IncP-1, IncP-7, and IncP-9 plasmids in a soil bacterial community. Applied and Environmental Microbiology. 80 (1), 138-145 (2014).
- Jarvis, B., Wilrich, C., Wilrich, P. T. Reconsideration of the derivation of most probable numbers, their standard deviations, confidence bounds and rarity values. Journal of Applied Microbiology. 109 (5), 1660-1667 (2010).
- Haagensen, J. A., Hansen, S. K., Johansen, T., Molin, S. In situ detection of horizontal transfer of mobile genetic elements. FEMS Microbiology Ecology. 42 (2), 261-268 (2002).
- Herrero, M., de Lorenzo, V., Timmis, K. N. Transposon vectors containing non-antibiotic resistance selection markers for cloning and stable chromosomal insertion of foreign genes in gram-negative bacteria. Journal of Bacteriology. 172 (11), 6557-6567 (1990).
- Bagdasarian, M., et al. Specific-purpose plasmid cloning vectors. II. Broad host range, high copy number, RSF1010-derived vectors, and a host-vector system for gene cloning in Pseudomonas. Gene. 16 (1-3), 237-247 (1981).
- Maeda, K., et al. Complete nucleotide sequence of carbazole/dioxin-degrading plasmid pCAR1 in Pseudomonas resinovorans strain CA10 indicates its mosaicity and the presence of large catabolic transposon Tn4676. Journal of Molecular Biology. 326 (1), 21-33 (2003).
- Takahashi, Y., Shintani, M., Yamane, H., Nojiri, H. The complete nucleotide sequence of pCAR2: pCAR2 and pCAR1 were structurally identical IncP-7 carbazole degradative plasmids. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 73 (3), 744-746 (2009).
