Dans le but de comprendre les comportements des divers éléments d’ADN conjugaison bactériennes dans des conditions différentes, les auteurs décrivent un protocole pour détecter les différences de fréquence de conjugaison, avec une haute résolution, pour estimer l’efficacité avec laquelle la bactérie donneur initie la conjugaison.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
Haute résolution comparaison des fréquences de la conjugaison bactérienne
Dans cet article
Résumé
Résumé
La conjugaison bactérienne est une étape importante dans le transfert horizontal de gènes de résistance aux antibiotiques par un élément d’ADN conjugatif. Comparaisons approfondies de la fréquence de conjugaison dans des conditions différentes sont nécessaires pour comprendre comment l’élément conjugaison se répand dans la nature. Cependant, les méthodes conventionnelles pour comparer la fréquence de la conjugaison ne conviennent pas pour les comparaisons de profondeur à cause de l’arrière-plan élevé causé par la survenance d’événements de conjugaison supplémentaires sur la gélose sélective. Nous avons réussi à réduire le fond en introduisant une méthode le plus probable (NPP) nombre et une plus forte concentration d’antibiotiques pour prévenir toute nouvelle conjugaison en milieu liquide sélectif. En outre, nous avons développé un protocole pour estimer la probabilité de la façon dont souvent donneur cellules conjugaison initier en triant les cellules du donneur unique dans des pools de bénéficiaires par cellule activée par fluorescence triant (FACS). À l’aide de deux plasmides, pBP136 et pCAR1, les différences de fréquence de conjugaison dans les cellules de Pseudomonas putida pourraient être détectés dans un milieu liquide à différentes vitesses d’agitation. Les fréquences de l’initiation de conjugaison étaient plus élevés pour les pBP136 que pour pCAR1. En utilisant ces résultats, nous pouvons mieux comprendre les fonctionnalités de la conjugaison de ces deux plasmides.
Introduction
La conjugaison bactérienne des éléments génétiques mobiles, les plasmides conjugatifs et éléments intégratives et conjugatifs (Ice) est importante pour la propagation horizontale de l’information génétique. Il peut favoriser l’adaptation et l’évolution bactérienne rapide et transmettre des gènes de résistance multidrogue1,2. La fréquence de conjugaison peut être affectée par les protéines codées sur les éléments de conjugaison pour la mobilisation de l’ADN (MOB) et de la formation de la paire correspondante (MPF), y compris les pili sexuels, qui est classés selon le type de la MOB et MPF3
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Protocole
1. préparation d’un donneur avec une protéine fluorescente verte (GFP)- et la kanamycine résistance Gene-tag plasmides
- Introduction de gènes marqueurs dans le pBP136 de plasmide de cible
Remarque : Le but du présent protocole est de générer pBP136 ::gfp. Les souches bactériennes et les plasmides utilisés dans cette étude sont énumérés au tableau 1.- Cultiver des cultures de Escherichia coli DH10B hébergeant pBP13617 dans 5 mL de bouillon stérile de Luria (LB) et e. coli S17-1λpir18 nourrissait pJBA28
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Résultats
Comparaison de la fréquence de la conjugaison par la méthode NPP
Dans notre précédent rapport, nous avons comparé la fréquence de la conjugaison des pBP136 ::gfp et pCAR1 ::gfp dans triple milieu liquide dilué LB (1/3 LB) avec des taux différents en remuant après un accouplement de 45 min à l’aide de 125 mL spinner flacons10. Nous avons comparé la fréquence de la conjugaison des pBP136 ::
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
Nous présentons ici un protocole haute résolution pour détecter les différences de fréquence de conjugaison dans des conditions différentes, en utilisant une méthode NPP pour estimer le nombre des transconjugants. Une étape importante dans le protocole est diluer le mélange du donneur et du receveur après l’accouplement jusqu'à ce qu’aucune des transconjugants ne grandir. Une autre étape est l’ajout des concentrations élevées d’antibiotiques dans le milieu liquid sélectif pour empêcher d’autres conjugaison. Ces procédure.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Nous remercions le Dr K. Kamachi de l’Institut National des maladies infectieuses (Japon) prévoyant la fourniture de pCAR1 de pBP136 et Prof. Dr. H. Nojiri, de l’Université de Tokyo (Japon). Nous sommes également reconnaissants à Professor Dr. Molin Sølen de l’Université technique du Danemark pour fournir pJBA28. Ce travail a été soutenu par JSPS KAKENHI (Grant Numbers 15H 05618 et 15KK0278) à MS (https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15H05618/, https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15KK0278/).
....Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| MoFlo XDP | Beckman-Coulter | ML99030 | FACS |
| IsoFlow | Beckman-Coulter | 8599600 | Solution de gaine |
| Fluorosphères (10 &mu ; m) | Beckman-Coulter | 6605359 | des billes pour la mise en place de l’incubateur FACS |
| Yamato Scientific Co. Ltd | 211197-IC802 | ||
| Spectrophotomètre UV-VIS UV-1800 | SIMADZU Corporation | UV-1800 | |
| Plaques à 96 puits | NIPPON Genetics Co, Ltd | TR5003 | |
| type de microplaque Boîte de Pétri | AXEL | 1-9668-01 | pour la validation du tri |
| filtre à membrane | ADVANTEC | C045A025A | pour filtre accouplement |
| pippettes | Nichiryo CO. Ltd | 00-NPX2-20, 00-NPX2-200, 00-NPX2-1000 | 0.5-10 &mu ; L, 20-200 &mu ; L, 100-1000 &mu ; L |
| pipettes multicanaux | Nichiryo CO. Ltd | 00-NPM-8VP, 00-NPM-8LP | 0.5-10 &mu ; L, 20-200 &mu ; L |
| Tryptone | BD Difco | 211705 | |
| Extrait de levure | BD Difco | 212750 | |
| NaCl | Sigma | S-5886 | |
| Agar | Nakarai tesque | 01162-15 | |
| rifampicine | Wako | 185-01003 | |
| gentamicine | Wako | 077-02974 | |
| kanamycine | Wako | 115-00342 | |
| Boîte de Pétri | AXEL | 3-1491-51 | JPND90-15 |
| microtubes | Fukaekasei | 131-815C | |
| 500 mL flacon jetable | Corning | CLS3578 |
Références
- Cabezon, E., Ripoll-Rozada, J., Pena, A., de la Cruz, F., Arechaga, I. Towards an integrated model of bacterial conjugation. FEMS Microbiology Reviews. 39 (1), 81-95 (2015).
- Johnson, C. M., Grossman, A. D. Integrative and conjugative elements (ICEs): what th....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
