С целью понять поведение различных бактериальных сопряженных ДНК элементов в различных условиях, мы описать протокол для выявления различий в частоте спряжение, с высоким разрешением, чтобы оценить, насколько эффективно бактерия доноров инициирует спряжение.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Высоким разрешением сравнение частот бактериальных спряжение
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Бактериальные спряжение является важным шагом в горизонтального переноса генов антибиотикорезистентности через элемент сопряженных ДНК. Углубленное сопоставление спряжение частоты в различных условиях требуется понять, как сопряженных элемент распространяется в природе. Однако обычные методы для сравнения частоты спряжение не подходят для углубленного сравнения из-за высокой фон, вызванные возникновение дополнительных спряжение событий на пластину выборочной. Мы успешно снизили фона путем внедрения наиболее вероятный метод чисел (MPN) и более высокую концентрацию антибиотиков для предотвращения дальнейшего сопряжения в селективной жидкой среде. Кроме того мы разработали протокол для оценки вероятности как часто доноров клеток инициировать спряжение сортировки одного донора клеток в получателей пулов активирован флуоресценции клеток, сортируя (FACS). С помощью двух плазмид, pBP136 и pCAR1, различия в спряжение частоты в Pseudomonas putida клетки могут быть обнаружены в жидкой среде с разной скоростью перемешивания. Частоты спряжение посвящения были выше, чем pBP136 для pCAR1. Используя эти результаты, мы можем лучше понять функции сопряжения этих двух плазмид.
Введение
Бактериальные спряжение мобильных генетических элементов, сопряженных плазмидов и интегративной и сопряженных элементов (ИКЕС) имеет важное значение для горизонтального распространения генетической информации. Это может способствовать быстрой бактериальных эволюции и адаптации и передавать гены множественной лекарственной устойчивости1,2. Спряжение частоты могут быть затронуты белков, закодированных на сопряженных элементы для мобилизации ДНК (MOB) и брачные пары формирования (MPF), включая секс пили, которые классифицируются в зависимости от толпы и МПФ тип3,
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Подготовка донора с зеленого флуоресцентного белка (ГФП)- и плазмид ген тегами канамицин сопротивления
- Введение маркерных генов в целевой плазмида pBP136
Примечание: Цель настоящего Протокола заключается в генерации pBP136::gfp. Штаммы бактерий и плазмиды, используемые в данном исследовании, перечислены в таблице 1.- Расти культур DH10B Escherichia coli укрывательство pBP13617 в 5 мл стерильной бульоне Лурия (LB) и E. coli S17-1λПир18 укрывательство pJBA2819 [содержащие канамицин ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Сравнение частоты спряжение методом MPN
В нашем предыдущем докладе, мы сравнили спряжение частоты pBP136::gfp и pCAR1::gfp в триединое разреженных фунтов (1/3 LB) жидкой среде с разной скоростью перемешивания после 45 мин спаривания с помощью счетчика 125 мл флакон10. Мы сравнили спряжение частоты pBP136::gfp и pCAR1::gfp с 106 кое/мл штаммов доноров и получател.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Здесь мы представляем разрешением протокол для выявления различий в частоте спряжения глаголов в различных условиях, с помощью метода MPN оценить количество трансконъюгантов. Один важный шаг в протоколе разбавления смеси доноров и получателей после спаривания до тех пор, пока не трансконъюгантов расти. Еще одним шагом является добавление высоких концентраций антибиотиков селективного жидкой среды для предотвращения дальнейшего сопряжения. Эти процедуры могут снизить фон, вызванные дальнейшего сопряжения в селективной сре.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Мы благодарим д-р K. Kamachi из Национального института инфекционных болезней (Япония) за предоставление pBP136 и профессор д-р H. Нодзири университета Токио (Япония) для обеспечения pCAR1. Мы признательны также профессор доктор Molin Sølen технического университета Дании за предоставление pJBA28. Эта работа была поддержана JSP-страницы KAKENHI (номера грантов 15H 05618 и 15KK0278) к MS (https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15H05618/, https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15KK0278/).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| MoFlo XDP | Beckman-Coulter | ML99030 | FACS |
| IsoFlow | Beckman-Coulter | 8599600 | Раствор |
| оболочки Флюоросферы (10 μ m) | Beckman-Coulter | 6605359 | бусины для создания инкубатора FACS |
| Yamato Scientific Co. Ltd | 211197-IC802 | ||
| УФ-ВИД спектрофотометр UV-1800 | SIMADZU Corporation | UV-1800 | |
| 96-луночные планшеты | NIPPON Genetics Co, Ltd | TR5003 | |
| микропланшетный тип чашка Петри | AXEL | 1-9668-01 | для валидации сортировки |
| мембранный фильтр | ADVANTEC | C045A025A | для фильтра сопрягаемых |
| пипетов | Nichiryo CO. Ltd | 00-NPX2-20, 00-NPX2-200, 00-NPX2-1000 | 0.5-10 μ L, 20-200 μ L, 100-1000 μ Л |
| многоканальные пипеты | Nichiryo CO. Ltd | 00-NPM-8VP, 00-NPM-8LP | 0.5-10 μ L, 20-200 μ L |
| Триптон | BD Difco | 211705 | |
| Экстракт дрожжей | BD Difco | 212750 | |
| NaCl | Sigma | S-5886 | |
| Агар | Накарай теске | 01162-15 | |
| рифампицин | Wako | 185-01003 | |
| гентамицин | Wako | 077-02974 | |
| канамицин | Wako | 115-00342 | |
| Чашка Петри | AXEL | 3-1491-51 | JPND90-15 |
| микропробирки | Fukaekasei | 131-815C | |
| 500 мл одноразовая колба | Corning | CLS3578 |
Ссылки
- Cabezon, E., Ripoll-Rozada, J., Pena, A., de la Cruz, F., Arechaga, I. Towards an integrated model of bacterial conjugation. FEMS Microbiology Reviews. 39 (1), 81-95 (2015).
- Johnson, C. M., Grossman, A. D. Integrative and conjugative elements (ICEs): what th....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
