Høj opløsning sammenligning af bakteriel konjugation frekvenser
Summary
Med formålet at forstå adfærd af forskellige bakterielle konjugering DNA elementer under forskellige forhold, vi beskriver en protokol til påvisning af forskelle i konjugation frekvens, med høj opløsning, til at vurdere, hvor effektivt donor bakterie initierer konjugering.
Abstract
Bakteriel konjugering er et vigtigt skridt i horisontal overførsel af antibiotikaresistensgener via en konjugering DNA element. Dybdegående sammenligninger af konjugation hyppighed under forskellige betingelser er forpligtet til at forstå, hvordan elementet konjugering spredes i naturen. Men konventionelle metoder til at sammenligne konjugation frekvens er ikke passende for dybdegående sammenligninger på grund af den høje baggrund forårsaget af forekomst af yderligere konjugation begivenheder på den udvalgte plade. Vi reduceret med succes baggrunden ved at indføre en mest sandsynlige tal (MPN) metode og en højere koncentration af antibiotika for at forhindre yderligere konjugation i selektiv flydende medium. Derudover udviklede vi en protokol til estimering af sandsynligheden for, hvordan ofte donor celler indlede konjugation af sortering enkeltdonor celler i modtagerens puljer af fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS). Bruger to plasmider, kunne pBP136 og pCAR1, forskelle i konjugation frekvens i Pseudomonas putida celler påvises i flydende substrat til forskellige omrøring priser. Hyppigheden af konjugation indledningen var højere for pBP136 end for pCAR1. Ved hjælp af disse resultater, kan vi bedre forstå konjugation egenskaber i disse to plasmider.
Introduction
Bakteriel konjugation af mobile genetiske elementer, konjugering plasmider og Integrativ og konjugering elementer (ICEs) er vigtigt for den horisontale spredning af genetisk information. Det kan fremme hurtig bakteriel evolution og tilpasning og overføre multidrug resistance gener1,2. Konjugation frekvens kan blive påvirket af proteiner kodet på konjugering elementer til mobilisering af DNA (MOB) og parring par dannelse (MPF), herunder sex pili, der er klassificeret efter MOB og MPF type3,4, 5. Det kan også blive påvirket af donor og recipient par6 og celler7,8,9,10,11,12 (vækstbetingelser vækstrate, celle tæthed, fast overflade eller flydende medium, temperatur, næringsstoftilgængelighed og tilstedeværelsen af kationer). For at forstå hvordan de konjugering elementer spredt blandt bakterier, er det nødvendigt at sammenligne konjugation frekvens i detaljer.
Konjugation frekvens mellem donor og recipient par efter parring er normalt anslået af konventionelle metoder som følger. a først, tælles antallet af donor og recipient kolonier; (ii) derefter, modtageren kolonierne, som modtog de konjugering elementer (= transconjugants) tælles; (iii) og endelig konjugation hyppighed beregnes ved at dividere de kolonidannende enheder (CFU) af transconjugants af dem, donor og/eller modtageren13. Men når du bruger denne metode, baggrunden er høj på grund af yderligere konjugation begivenheder, der kan også opstå på de selektive plader anvendes til at opnå transconjugants, når celle tæthed er høj10. Derfor er det vanskeligt at opdage små forskelle i frekvens (under en 10-fold forskel). Vi har for nylig indført en mest sandsynlige tal (MPN) metode ved hjælp af flydende medium, der indeholder en højere koncentration af antibiotika. Denne metode reduceret baggrunden ved at hæmme yderligere konjugation i selektivt medie; således kan konjugation hyppigheden anslås med højere opløsning.
Konjugation kan opdeles i tre trin: (1) fastgørelse af donor-modtager par (2) indledning af konjugering overførsel, og (3) dissociation af par14. Under trin (1) og (3) er der fysisk interaktion mellem donor og recipient celler; således kan celle tæthed og de miljømæssige forhold påvirke disse trin, selv om funktionerne i sex-pili er også vigtige. Trin (2) er sandsynligvis reguleret ved ekspression af flere gener involveret i konjugation som svar på eksterne ændringer, som kunne påvirkes af forskellige funktioner i plasmid, donor og recipient. Selv om fysisk beslaglæggelse eller udstationering af donor-modtager par kan matematisk simuleres ved hjælp af en vurdering af celler som partikler, bør hyppigheden af trin (2) måles eksperimentelt. Der har været nogle rapporter om direkte observationer af hvordan ofte donorer kan indlede konjugation [trin (2)] ved hjælp af Fluorescens mikroskopi15,16; men disse metoder er ikke høj overførselshastighed, fordi et stort antal celler skal overvåges. Derfor, har vi udviklet en ny metode til at vurdere sandsynligheden for forekomst af trin (2) ved hjælp af fluorescens aktiveret celle sortering (FACS). Vores metode kan anvendes på enhver plasmid, uden identifikation af væsentlige gener for konjugering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi præsenterer her, en høj opløsning protokol til påvisning af forskelle i konjugation hyppighed under forskellige betingelser, ved hjælp af en MPN metode til at anslå antallet af transconjugants. Et vigtigt skridt i protokollen fortynding blanding af donor og recipient efter parring indtil ingen transconjugants vokse. Et andet skridt er at tilføje høje koncentrationer af antibiotika til selektiv flydende medium til at forhindre yderligere konjugering. Disse procedurer kan reducere baggrunden forårsaget af yderl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takke Dr. K. Kamachi af det nationale Institut for smitsomme sygdomme (Japan) for at give pBP136 og Prof. Dr. H. Nojiri fra University of Tokyo (Japan) for at give pCAR1. Vi er også taknemmelige til Professor Dr. Molin Sølen af Danmarks Tekniske Universitet for at give pJBA28. Dette arbejde blev støttet af JSPS KAKENHI (Grant numre 15H 05618 og 15KK0278) til MS (https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15H05618/, https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15KK0278/).
Materials
| MoFlo XDP | Beckman-Coulter | ML99030 | FACS |
| IsoFlow | Beckman-Coulter | 8599600 | Sheath solution |
| Fluorospheres (10 μm) | Beckman-Coulter | 6605359 | beads to set up the FACS |
| Incubator | Yamato Scientific Co. Ltd | 211197-IC802 | |
| UV-VIS Spectrophotometer UV-1800 | SIMADZU Corporation | UV-1800 | |
| 96-well plates | NIPPON Genetics Co, Ltd | TR5003 | |
| microplate type Petri dish | AXEL | 1-9668-01 | for validation of sorting |
| membrane filter | ADVANTEC | C045A025A | for filter mating |
| pippettes | Nichiryo CO. Ltd | 00-NPX2-20, 00-NPX2-200, 00-NPX2-1000 |
0.5-10 μL, 20-200 μL, 100-1000 μL |
| multi-channel pippetes | Nichiryo CO. Ltd | 00-NPM-8VP, 00-NPM-8LP |
0.5-10 μL, 20-200 μL |
| Tryptone | BD Difco | 211705 | |
| Yeast extract | BD Difco | 212750 | |
| NaCl | Sigma | S-5886 | |
| Agar | Nakarai tesque | 01162-15 | |
| rifampicin | Wako | 185-01003 | |
| gentamicin | Wako | 077-02974 | |
| kanamycin | Wako | 115-00342 | |
| Petri dish | AXEL | 3-1491-51 | JPND90-15 |
| microtubes | Fukaekasei | 131-815C | |
| 500 mL disposable spinner flask | Corning | CLS3578 |
References
- Cabezon, E., Ripoll-Rozada, J., Pena, A., de la Cruz, F., Arechaga, I. Towards an integrated model of bacterial conjugation. FEMS Microbiology Reviews. 39 (1), 81-95 (2015).
- Johnson, C. M., Grossman, A. D. Integrative and conjugative elements (ICEs): what they do and how they work. Annual Review of Genetics. 49, 577-601 (2015).
- Garcillán-Barcia, M. P., Alvarado, A., de la Cruz, F. Identification of bacterial plasmids based on mobility and plasmid population biology. FEMS Microbiology Reviews. 35 (5), 936-956 (2011).
- Smillie, C., Garcillán-Barcia, M. P., Francia, M. V., Rocha, E. P., de la Cruz, F. Mobility of plasmids. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74 (3), 434-452 (2010).
- Garcillán-Barcia, M. P., Francia, M. V., de la Cruz, F. The diversity of conjugative relaxases and its application in plasmid classification. FEMS Microbiology Reviews. 33 (3), 657-687 (2009).
- Shintani, M., et al. Recipient range of IncP-7 conjugative plasmid pCAR2 from Pseudomonas putida HS01 is broader than from other Pseudomonas strains. Biotechnology Letters. 27 (23-24), 1847-1853 (2005).
- Yanagida, K., et al. Comparisons of the transferability of plasmids pCAR1, pB10, R388, and NAH7 among Pseudomonas putida at different cell densities. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 80 (5), 1020-1023 (2016).
- Schuurmans, J. M., et al. Effect of growth rate and selection pressure on rates of transfer of an antibiotic resistance plasmid between E. coli strains. Plasmid. 72, 1-8 (2014).
- Bradley, D. E., Taylor, D. E., Cohen, D. R. Specification of surface mating systems among conjugative drug resistance plasmids in Escherichia coli K-12. Journal of Bacteriology. 143 (3), 1466-1470 (1980).
- Nakazawa, S., et al. Different transferability of incompatibility (Inc) P-7 plasmid pCAR1 and IncP-1 plasmid pBP136 in stirring liquid conditions. PLoS One. 12 (10), e0186248 (2017).
- Verma, T., Ramteke, P. W., Garg, S. K. Effect of ecological factors on conjugal transfer of chromium-resistant plasmid in Escherichia coli isolated from tannery effluent. Biotechnology and Applied Biochemistry. 102 (1-6), 5-20 (2002).
- Sakuda, A., et al. Divalent cations increase the conjugation efficiency of the incompatibility P-7 group plasmid pCAR1 among different Pseudomonas hosts. Microbiology. 164 (1), 20-27 (2018).
- Corliss, T. L., Cohen, P. S., Cabelli, V. J. R-plasmid transfer to and from Escherichia coli strains Isolated from human fecal samples. Applied and Environmental Microbiology. 41 (4), 959-966 (1981).
- Zhong, X., Krol, J. E., Top, E. M., Krone, S. M. Accounting for mating pair formation in plasmid population dynamics. Journal of Theoretical Biology. 262 (4), 711-719 (2010).
- Gilmour, M. W., Lawley, T. D., Taylor, D. E. The cytology of bacterial conjugation. EcoSal Plus. 2004, (2004).
- Minoia, M., et al. Stochasticity and bistability in horizontal transfer control of a genomic island in Pseudomonas. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (52), 20792-20797 (2008).
- Kamachi, K., et al. Plasmid pBP136 from Bordetella pertussis represents an ancestral form of IncP-1beta plasmids without accessory mobile elements. Microbiology. 152 (12), 3477-3484 (2006).
- Simon, R., Priefer, U., Pühler, A. A broad host range mobilization system for in vivo genetic engineering: transposon mutagenesis in gram negative bacteria. Nature Biotechnology. 1 (9), 784-791 (1983).
- Andersen, J. B., et al. New unstable variants of green fluorescent protein for studies of transient gene expression in bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 64 (6), 2240-2246 (1998).
- Shintani, M., et al. Characterization of the replication, maintenance, and transfer features of the IncP-7 plasmid pCAR1, which carries genes involved in carbazole and dioxin degradation. Applied and Environmental Microbiology. 72 (5), 3206-3216 (2006).
- Shintani, M., et al. Single-cell analyses revealed transfer ranges of IncP-1, IncP-7, and IncP-9 plasmids in a soil bacterial community. Applied and Environmental Microbiology. 80 (1), 138-145 (2014).
- Jarvis, B., Wilrich, C., Wilrich, P. T. Reconsideration of the derivation of most probable numbers, their standard deviations, confidence bounds and rarity values. Journal of Applied Microbiology. 109 (5), 1660-1667 (2010).
- Haagensen, J. A., Hansen, S. K., Johansen, T., Molin, S. In situ detection of horizontal transfer of mobile genetic elements. FEMS Microbiology Ecology. 42 (2), 261-268 (2002).
- Herrero, M., de Lorenzo, V., Timmis, K. N. Transposon vectors containing non-antibiotic resistance selection markers for cloning and stable chromosomal insertion of foreign genes in gram-negative bacteria. Journal of Bacteriology. 172 (11), 6557-6567 (1990).
- Bagdasarian, M., et al. Specific-purpose plasmid cloning vectors. II. Broad host range, high copy number, RSF1010-derived vectors, and a host-vector system for gene cloning in Pseudomonas. Gene. 16 (1-3), 237-247 (1981).
- Maeda, K., et al. Complete nucleotide sequence of carbazole/dioxin-degrading plasmid pCAR1 in Pseudomonas resinovorans strain CA10 indicates its mosaicity and the presence of large catabolic transposon Tn4676. Journal of Molecular Biology. 326 (1), 21-33 (2003).
- Takahashi, Y., Shintani, M., Yamane, H., Nojiri, H. The complete nucleotide sequence of pCAR2: pCAR2 and pCAR1 were structurally identical IncP-7 carbazole degradative plasmids. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 73 (3), 744-746 (2009).
