Høyoppløselig sammenligning av bakteriell Bøyning frekvenser
Summary
Har som mål å forstå oppførsel av ulike bakteriell konjugerbart DNA elementer under ulike forhold, beskriver vi en protokoll for å oppdage forskjeller i Bøyning frekvens, med høy oppløsning, å anslå hvor effektivt donor bakterien starter Bøyning.
Abstract
Bakteriell Bøyning er et viktig skritt i vannrett overføring av antibiotikaresistens gener via en konjugerbart DNA-element. Grundig sammenligninger av Bøyning frekvens under ulike forhold må forstå hvordan konjugerbart elementet spres i naturen. Men er konvensjonelle metoder for å sammenligne Bøyning frekvens ikke hensiktsmessig for grundig sammenligninger på grunn av høy bakgrunnen forårsaket av forekomsten av ekstra Bøyning hendelser på selektiv tallerkenen. Vi redusert har bakgrunnen ved å innføre en mest sannsynlig (MPN) metode og en høyere konsentrasjon av antibiotika for å hindre ytterligere bøyning i selektiv flytende medium. Dessuten, utviklet vi en protokoll for å anslå sannsynligheten for hvor ofte donor cellene initiere Bøyning av sortering enkelt donor cellene i mottakerens bassenger fluorescens-aktivert celle sortering (FACS). Bruker to plasmider, pBP136 og pCAR1, forskjellene i Bøyning frekvens i Pseudomonas putida celler ble oppdaget i flytende medium til forskjellige gripende priser. Frekvenser av Bøyning innvielsen var høyere for pBP136 enn for pCAR1. Med disse resultatene, kan vi bedre forstå funksjonene bøyning i disse to plasmider.
Introduction
Bakteriell Bøyning av mobile genetiske elementer, konjugerbart plasmider og integrerende og konjugerbart elementer (ICEs) er viktig for vannrett spredning av genetisk informasjon. Fremme rask bakteriell utvikling og tilpasning kan og overføre multidrug motstand gener1,2. Bøyning frekvensen kan påvirkes av proteiner kodet på konjugerbart elementer for mobilisering av DNA (MOB) og paring par dannelse (MPF), inkludert sex pili, som er klassifisert i henhold til MOB og MPF type3,4, 5. Det kan også påvirkes av giver og mottaker par6 til vekst i celler7,8,9,10,11,12 ( vekst, celle tetthet, solid overflate eller flytende medium, temperatur, næringsinnhold tilgjengelighet og tilstedeværelsen av kasjoner). For å forstå hvordan konjugerbart elementer spredt blant bakterier, er det nødvendig å sammenligne Bøyning frekvens i detalj.
Bøyning frekvensen mellom giver og mottaker par etter mating er vanligvis beregnet av konvensjonelle metoder slik. (i) først, telles antall giver og mottaker koloniene; (ii) deretter blir mottaker koloniene, som fikk konjugerbart elementene (= transconjugants) telt. (iii) og til slutt Bøyning frekvensen beregnes ved kolonien forming enheter (CFU) av transconjugants av donor og/eller mottakeren13. Men når du bruker denne metoden, er bakgrunnen høyt på grunn av ekstra Bøyning hendelser som kan også forekomme på selektiv platene brukes til å få transconjugants når cellen tetthet er høy10. Derfor er det vanskelig å oppdage små forskjeller i frekvens (under en 10 ganger forskjell). Vi har nylig introdusert en mest sannsynlig (MPN) metode ved hjelp av flytende medium som inneholder en høyere konsentrasjon av antibiotika. Denne metoden redusert bakgrunnen ved å hemme ytterligere bøyning i selektiv medium; Dermed kan Bøyning frekvensen anslås med høyere oppløsning.
Bøyning kan deles inn i tre trinn: (1) vedlegg av donor-mottaker par (2) initiering av konjugerbart overføring, og (3) dissosiasjon par14. Under trinn (1) og (3) er det fysisk interaksjon mellom giver og mottaker celler. Dermed kan celle tetthet og miljømessige forhold påvirke disse trinnene, men funksjonene i sex pili er også viktig. Trinn (2) er sannsynligvis regulert av uttrykk for flere gener involvert i Bøyning svar på eksterne endringer, som kan bli berørt av ulike funksjoner av plasmider, giver og mottaker. Selv om den fysiske vedlegg eller avdeling av donor-mottaker kan matematisk simuleres med en vurdering av celler som partikler, bør antallet trinn (2) måles eksperimentelt. Det har vært noen rapporter om direkte observasjoner av hvordan ofte givere kan starte Bøyning [trinn (2)] med fluorescens mikroskopi15,16; disse metodene er imidlertid ikke høy gjennomstrømming fordi et stort antall celler må overvåkes. Derfor har vi utviklet en ny metode for å beregne sannsynligheten for forekomsten av trinn (2) ved hjelp av fluorescens aktivert celle sortering (FACS). Vår metode kan brukes på noen plasmider, uten identifikasjon av viktige genene for Bøyning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her presenterer vi en høyoppløselig protokoll for å oppdage forskjeller i Bøyning frekvens under ulike forhold, med en MPN-metode til å beregne antall transconjugants. En viktig del av protokollen er fortynne blanding av giver og mottaker etter parring inntil ingen transconjugants vokse. Et annet skritt er å legge høye konsentrasjoner av antibiotika til selektiv flytende medium å hindre ytterligere Bøyning. Disse prosedyrene kan redusere bakgrunnen forårsaket av ytterligere bøyning i selektiv medium. Vi kunne …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. K. Kamachi av National Institute av smittsomme sykdommer (Japan) for å gi pBP136 og Prof. Dr. H. Nojiri ved University of Tokyo (Japan) for å gi pCAR1. Vi er også takknemlige for Professor Dr. Molin Sølen av Danmarks tekniske universitet for å gi pJBA28. Dette arbeidet ble støttet av JSPS KAKENHI (Grant tall 15H 05618 og 15KK0278) til MS (https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15H05618/, https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15KK0278/).
Materials
| MoFlo XDP | Beckman-Coulter | ML99030 | FACS |
| IsoFlow | Beckman-Coulter | 8599600 | Sheath solution |
| Fluorospheres (10 μm) | Beckman-Coulter | 6605359 | beads to set up the FACS |
| Incubator | Yamato Scientific Co. Ltd | 211197-IC802 | |
| UV-VIS Spectrophotometer UV-1800 | SIMADZU Corporation | UV-1800 | |
| 96-well plates | NIPPON Genetics Co, Ltd | TR5003 | |
| microplate type Petri dish | AXEL | 1-9668-01 | for validation of sorting |
| membrane filter | ADVANTEC | C045A025A | for filter mating |
| pippettes | Nichiryo CO. Ltd | 00-NPX2-20, 00-NPX2-200, 00-NPX2-1000 |
0.5-10 μL, 20-200 μL, 100-1000 μL |
| multi-channel pippetes | Nichiryo CO. Ltd | 00-NPM-8VP, 00-NPM-8LP |
0.5-10 μL, 20-200 μL |
| Tryptone | BD Difco | 211705 | |
| Yeast extract | BD Difco | 212750 | |
| NaCl | Sigma | S-5886 | |
| Agar | Nakarai tesque | 01162-15 | |
| rifampicin | Wako | 185-01003 | |
| gentamicin | Wako | 077-02974 | |
| kanamycin | Wako | 115-00342 | |
| Petri dish | AXEL | 3-1491-51 | JPND90-15 |
| microtubes | Fukaekasei | 131-815C | |
| 500 mL disposable spinner flask | Corning | CLS3578 |
References
- Cabezon, E., Ripoll-Rozada, J., Pena, A., de la Cruz, F., Arechaga, I. Towards an integrated model of bacterial conjugation. FEMS Microbiology Reviews. 39 (1), 81-95 (2015).
- Johnson, C. M., Grossman, A. D. Integrative and conjugative elements (ICEs): what they do and how they work. Annual Review of Genetics. 49, 577-601 (2015).
- Garcillán-Barcia, M. P., Alvarado, A., de la Cruz, F. Identification of bacterial plasmids based on mobility and plasmid population biology. FEMS Microbiology Reviews. 35 (5), 936-956 (2011).
- Smillie, C., Garcillán-Barcia, M. P., Francia, M. V., Rocha, E. P., de la Cruz, F. Mobility of plasmids. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74 (3), 434-452 (2010).
- Garcillán-Barcia, M. P., Francia, M. V., de la Cruz, F. The diversity of conjugative relaxases and its application in plasmid classification. FEMS Microbiology Reviews. 33 (3), 657-687 (2009).
- Shintani, M., et al. Recipient range of IncP-7 conjugative plasmid pCAR2 from Pseudomonas putida HS01 is broader than from other Pseudomonas strains. Biotechnology Letters. 27 (23-24), 1847-1853 (2005).
- Yanagida, K., et al. Comparisons of the transferability of plasmids pCAR1, pB10, R388, and NAH7 among Pseudomonas putida at different cell densities. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 80 (5), 1020-1023 (2016).
- Schuurmans, J. M., et al. Effect of growth rate and selection pressure on rates of transfer of an antibiotic resistance plasmid between E. coli strains. Plasmid. 72, 1-8 (2014).
- Bradley, D. E., Taylor, D. E., Cohen, D. R. Specification of surface mating systems among conjugative drug resistance plasmids in Escherichia coli K-12. Journal of Bacteriology. 143 (3), 1466-1470 (1980).
- Nakazawa, S., et al. Different transferability of incompatibility (Inc) P-7 plasmid pCAR1 and IncP-1 plasmid pBP136 in stirring liquid conditions. PLoS One. 12 (10), e0186248 (2017).
- Verma, T., Ramteke, P. W., Garg, S. K. Effect of ecological factors on conjugal transfer of chromium-resistant plasmid in Escherichia coli isolated from tannery effluent. Biotechnology and Applied Biochemistry. 102 (1-6), 5-20 (2002).
- Sakuda, A., et al. Divalent cations increase the conjugation efficiency of the incompatibility P-7 group plasmid pCAR1 among different Pseudomonas hosts. Microbiology. 164 (1), 20-27 (2018).
- Corliss, T. L., Cohen, P. S., Cabelli, V. J. R-plasmid transfer to and from Escherichia coli strains Isolated from human fecal samples. Applied and Environmental Microbiology. 41 (4), 959-966 (1981).
- Zhong, X., Krol, J. E., Top, E. M., Krone, S. M. Accounting for mating pair formation in plasmid population dynamics. Journal of Theoretical Biology. 262 (4), 711-719 (2010).
- Gilmour, M. W., Lawley, T. D., Taylor, D. E. The cytology of bacterial conjugation. EcoSal Plus. 2004, (2004).
- Minoia, M., et al. Stochasticity and bistability in horizontal transfer control of a genomic island in Pseudomonas. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (52), 20792-20797 (2008).
- Kamachi, K., et al. Plasmid pBP136 from Bordetella pertussis represents an ancestral form of IncP-1beta plasmids without accessory mobile elements. Microbiology. 152 (12), 3477-3484 (2006).
- Simon, R., Priefer, U., Pühler, A. A broad host range mobilization system for in vivo genetic engineering: transposon mutagenesis in gram negative bacteria. Nature Biotechnology. 1 (9), 784-791 (1983).
- Andersen, J. B., et al. New unstable variants of green fluorescent protein for studies of transient gene expression in bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 64 (6), 2240-2246 (1998).
- Shintani, M., et al. Characterization of the replication, maintenance, and transfer features of the IncP-7 plasmid pCAR1, which carries genes involved in carbazole and dioxin degradation. Applied and Environmental Microbiology. 72 (5), 3206-3216 (2006).
- Shintani, M., et al. Single-cell analyses revealed transfer ranges of IncP-1, IncP-7, and IncP-9 plasmids in a soil bacterial community. Applied and Environmental Microbiology. 80 (1), 138-145 (2014).
- Jarvis, B., Wilrich, C., Wilrich, P. T. Reconsideration of the derivation of most probable numbers, their standard deviations, confidence bounds and rarity values. Journal of Applied Microbiology. 109 (5), 1660-1667 (2010).
- Haagensen, J. A., Hansen, S. K., Johansen, T., Molin, S. In situ detection of horizontal transfer of mobile genetic elements. FEMS Microbiology Ecology. 42 (2), 261-268 (2002).
- Herrero, M., de Lorenzo, V., Timmis, K. N. Transposon vectors containing non-antibiotic resistance selection markers for cloning and stable chromosomal insertion of foreign genes in gram-negative bacteria. Journal of Bacteriology. 172 (11), 6557-6567 (1990).
- Bagdasarian, M., et al. Specific-purpose plasmid cloning vectors. II. Broad host range, high copy number, RSF1010-derived vectors, and a host-vector system for gene cloning in Pseudomonas. Gene. 16 (1-3), 237-247 (1981).
- Maeda, K., et al. Complete nucleotide sequence of carbazole/dioxin-degrading plasmid pCAR1 in Pseudomonas resinovorans strain CA10 indicates its mosaicity and the presence of large catabolic transposon Tn4676. Journal of Molecular Biology. 326 (1), 21-33 (2003).
- Takahashi, Y., Shintani, M., Yamane, H., Nojiri, H. The complete nucleotide sequence of pCAR2: pCAR2 and pCAR1 were structurally identical IncP-7 carbazole degradative plasmids. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 73 (3), 744-746 (2009).
