Essai de co-immunoprécipitation des protéines nucléaires endogènes de cellules cultivées dans des Conditions hypoxiques
Summary
Nous décrivons ici un protocole co-immunoprécipitation pour étudier les interactions protéine-protéine entre les protéines nucléaires endogènes dans des conditions hypoxiques. Cette méthode convient pour la démonstration des interactions entre les facteurs de transcription et les corégulateurs transcriptionnels à l’hypoxie.
Abstract
Faibles teneurs en oxygène (hypoxie) déclenchent une variété de réponses adaptatives avec le Hypoxia-inducible factor complexe agissant comme un maître régulateur 1 (HIF-1). HIF-1 se compose d’une sous-unité α oxygène régulée des hétérodimères (HIF-1 bis) et exprimé constitutivement sous-unité β (HIF-1β) également connu sous le nom aryl hydrocarbon receptor nucléaire translocator (ARNT), régulation des gènes impliqués dans divers processus, y compris l’angiogenèse , l’érythropoïèse et la glycolyse. L’identification des protéines qui interagissent HIF-1 est essentielle à la compréhension de la voie de signalisation de l’hypoxie. Sans compter que la régulation de la stabilité de l’HIF-1α, hypoxie déclenche également la translocation nucléaire de nombreux facteurs de transcription dont HIF-1α et ARNT. Notamment, la plupart des méthodes actuelles utilisées pour étudier ces interactions protéine-protéine (IPP) sont basés sur les systèmes où les taux de protéines sont artificiellement augmentés par la surexpression de la protéine. Surexpression de la protéine souvent conduit à des résultats non physiologiques dus aux artefacts temporelles et spatiales. Nous décrivons ici une co-immunoprécipitation mis à jour le protocole après le traitement de l’hypoxie en utilisant des protéines nucléaires endogènes et comme une preuve de concept, de montrer l’interaction entre HIF-1α et ARNT. Dans le présent protocole, les cellules hypoxiques ont été récoltés dans des conditions hypoxiques et tampon de lavage de la Dulbecco Phosphate-Buffered Saline (SPD) a également été préalablement équilibré à des conditions hypoxiques avant son utilisation afin d’atténuer la dégradation des protéines ou complexes de protéines dissociation durant la réoxygénation. En outre, les fractions nucléaires ont été par la suite extraites de façon à se concentrer et de stabiliser les protéines nucléaires endogènes et d’éviter de possibles résultats fallacieux souvent vu au cours de la surexpression de la protéine. Ce protocole peut être utilisé pour démontrer endogènes et natives des interactions entre les facteurs de transcription et les corégulateurs transcriptionnels dans des conditions hypoxiques.
Introduction
L’hypoxie se produit lorsque l’oxygène insuffisant est fournie pour les cellules et les tissus du corps. Il joue un rôle critique dans divers processus physiologiques et pathologiques tels que la différenciation des cellules souches, l’inflammation et le cancer1,2. Facteurs inductibles par l’hypoxie (HIFs) fonctionnent comme des hétérodimères composé d’une sous-unité α réglementés d’oxygène et une sous-unité β constitutivement exprimé également connu sous le nom de ARNT3. Trois isoformes des sous-unités HIF-α (HIF-1α, HIF-2α et HIF-3α) et trois sous-unités β HIF (ARNT/HIF-1β, ARNT2 et ARNT3) ont été identifiées à ce jour. HIF-1α et ARNT sont exprimés ubiquitaire, alors que HIF-2α, HIF-3α, ARNT2 et ARNT3 ont plus restreinte de modèles expression4. La complexe de la protéine HIF-1 est le régulateur essentiel de la réponse de l’hypoxie. Dans des conditions hypoxiques, HIF-1α devient stabilisé, puis translocation vers le noyau et se dimérise avec ARNT5. Par la suite, ce complexe se lie à des nucléotides spécifiques appelés éléments sensibles de l’hypoxie (HREs) et régule l’expression de gènes cibles impliqués dans divers processus, y compris de l’angiogenèse, l’érythropoïèse et la glycolyse6. En plus de cette réponse « canonique », la voie de signalisation de l’hypoxie est également connue pour la diaphonie avec plusieurs réponse cellulaire signalisation tels que Notch et nucléaire facteur-kappa B (NF-κB)7,8,,9.
L’identification des protéines qui interagissent roman HIF-1 est importante pour une meilleure compréhension de la voie de signalisation de l’hypoxie. Contrairement à l’ARNT, ce qui est insensible aux niveaux d’oxygène et constitutivement exprimé, des niveaux de protéine HIF-1α sont étroitement contrôlée par les niveaux d’oxygène cellulaire. À la normoxie (21 % d’oxygène), HIF-1α protéines sont rapidement dégradées10,11. La courte demi-vie de HIF-1α à normoxie présente des défis techniques spécifiques pour la détection de la protéine d’extraits cellulaires, ainsi que pour l’identification des protéines d’HIF-1α-interaction. En outre, plusieurs facteurs de transcription, dont celles du complexe HIF-1 translocation dans le noyau sous conditions hypoxiques12,13,14. La plupart des méthodes actuelles utilisées pour les études PPI est effectuée au moyen de la surexpression de protéines non physiologiques. La surexpression de cette protéine a été signalée pour causer des défauts cellulaires différents par le biais de plusieurs mécanismes, y compris la surcharge de ressource, déséquilibre stoechiométrique, interactions promiscuitées et voie modulation15,16. En ce qui concerne les études de l’IPP, la surexpression de protéines peut conduire à faux positif, ou même faussement négatif, des résultats selon les propriétés de la protéine et la fonction des protéines surexprimées. Par conséquent, les méthodes actuelles pour les études PPI devront être modifiées afin de révéler les IPP physiologiquement pertinents dans des conditions hypoxiques. Nous avons déjà démontré l’interaction entre HIF-1 et le facteur de transcription famille de Ets la protéine liant le GA (GABP) dans les cellules hypoxiques P19, qui contribue à la réponse du promoteur Hes1 à hypoxie17. Nous décrivons ici un protocole co-immunoprécipitation pour étudier les IPP entre protéines nucléaires endogènes dans des conditions hypoxiques. L’interaction entre HIF-1α et ARNT est présentée comme une preuve de concept. Ce protocole est conçu pour démontrer les interactions entre les facteurs de transcription et les corégulateurs transcriptionnels dans des conditions hypoxiques, incluant mais non limité à l’identification des protéines qui interagissent HIF-1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le complexe de HIF-1 est un maître régulateur de l’homéostasie cellulaire de l’oxygène et réglemente une pléthore de gènes impliqués dans les différentes réponses adaptatives cellulaires à l’hypoxie. Identification de nouvelles protéines qui interagissent de HIF-1 est importante pour la compréhension de la transduction du signal hypoxique. Co-Immunoprécipitation expériences sont couramment utilisés pour les études de l’IPP pour délimiter les voies de transduction de signal cellulaire. Cependant,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Assoc. Prof. Sin Tiong Ong pour l’utilisation de la plateforme de l’hypoxie. Ce travail a été soutenu par ce qui suit : Singapour Ministry of Education, MOE 1 t 1-02/04 et MOE2015-T2-2-087 (à Y.A.), Lee Kong Chian School of Medicine, subvention de démarrage de Nanyang Technological University M4230003 (à P.O.B.), le Conseil de recherche suédois, le Erling Persson Fondation de la famille, le Novo Nordisk Foundation, la Stichting af Jochnick Fondation, l’Association suédoise du diabète, la compagnie d’assurance de Scandia, la recherche sur le diabète et Wellness, Fondation de couchette von Kantzow, le Programme de recherche stratégique dans le diabète au Karolinska Institutet, l’ERC ERC-2013-AdG 338936-Betalmage et Knut et Alice Wallenberg Foundation.
Materials
| Material | |||
| 1.0 M Tris-HCl Buffer, pH 7.4 | 1st BASE | 1415 | |
| Protein A/G Sepharose beads | Abcam | ab193262 | |
| Natural Mouse IgG protein | Abcam | ab198772 | |
| EDTA | Bio-Rad | 1610729 | |
| 2x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610737 | |
| 2-Mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610710 | |
| Nitrocellulose Membrane | Bio-Rad | 1620112 | |
| Blotting-Grade Blocker | Bio-Rad | 1706404 | Non-fat dry milk for western blotting applications |
| 10x Tris Buffered Saline (TBS) | Bio-Rad | 1706435 | |
| 10% Tween 20 | Bio-Rad | 1610781 | |
| 10x Tris/Glycine/SDS | Bio-Rad | 1610732 | |
| 10x Tris/Glycine Buffer | Bio-Rad | 1610771 | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio-Rad | 1610374 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7074 | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7076 | |
| SignalFire ECL Reagent | Cell Signaling | 6883 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Corning | 21-030-CV | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Merck Millipore | 52332 | |
| ARNT/HIF-1 beta Antibody | Novus Biologicals | NB100-124 | Concentration: 1.4 mg/mL |
| HIF-1 alpha Antibody | Novus Biologicals | NB100-479 | Concentration: 1.0 mg/mL |
| YY1 Antibody | Novus Biologicals | NBP1-46218 | Concentration: 0.2 mg/mL |
| Qproteome Nuclear Protein Kit | Qiagen | 37582 | Lysis buffer NL and Extraction Buffer NX1 are provied in the kit |
| GAPDH Antibody | Santa Cruz | sc-47724 | Concentration: 0.2 mg/mL |
| Glycerol (≥99%) | Sigma | G5516 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| RIPA buffer | Sigma | R0278 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | 71376 | |
| NP-40 | Sigma | 127087-87-0 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM, 4.5 g/L glucose) | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher Scientific | R0861 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10270106 | |
| HEK293A cell line | Thermo Fisher Scientific | R70507 | |
| Methanol | Thermo Fisher Scientific | 67-56-1 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Pierce Protease Inhibitor Tablets | Thermo Fisher Scientific | 88660 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| QSP gel loading tip | Thermo Fisher Scientific | QSP#010-R204-Q-PK | 1-200 uL |
| Equipment/Instrument | |||
| Thick Blot Filter Paper, Precut, 7.5 x 10 cm | Bio-Rad | 1703932 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, with Mini Trans-Blot Module and PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1658034 | |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | Bio-Rad | 4561083 | |
| ChemiDoc XRS+ System | Bio-Rad | 1708265 | |
| I-Glove | BioSpherix | I-Glove | |
| Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader | BioTek | BTS1LFTA | |
| Costar 5mL Stripette Serological Pipets | Corning | 4487 | |
| Costar 10mL Stripette Serological Pipets | Corning | 4488 | |
| Costar 25mL Stripette Serological Pipets | Corning | 4251 | |
| Corning 96-Well Clear Bottom Black Polystyrene Microplates | Corning | 3631 | |
| 15mL High Clarity PP conical Centrifuge Tubes | Corning | 352095 | |
| Small Cell Scraper | Corning | 3010 | |
| Gilson Pipetman L 4-pipettes kit | Gilson | F167370 | P2, P20, P200, P1000 and accessories |
| 1.5mL Polypropylene Microcentrifuge Tubes | Greiner Bio-One | 616201 | |
| PIPETBOY acu 2 Pipettor | INTEGRA Biosciences | 155 000 | |
| Justrite Flammable Liquid Storage Cabinets | Justrite Manufacturing Co. | 896000 | |
| Vortex mixer | Labnet | S0200 | |
| CO2 incubator | NuAire | NU-5820 | |
| Orbital shakers | Stuart | SSL1 | |
| Tube rotator SB3 | Stuart | SB3 | |
| MicroCL 21R Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002470 | |
| Sorvall ST 16 Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004240 | |
| Tissue Culture Dishes (100 mm) | Thermo Fisher Scientific | 150350 | |
| Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device | Thermo Fisher Scientific | 69580 | 10K MWCO, 0.1 mL |
| Float Buoys for 0.1mL Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Devices | Thermo Fisher Scientific | 69588 | |
| LSE Digital Dry Bath Heaters | Thermo Fisher Scientific | 1168H25 | |
| Thermo Scientific 1300 Series A2 Class II, Type A2 Bio Safety Cabinets | Thermo Fisher Scientific | 13-261-308 | |
| Software | |||
| Image Lab Software | Bio-Rad | 1709691 |
References
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