Analisi di co-immunoprecipitazione utilizzando proteine endogene nucleari da cellule coltivate in condizioni di ipossia
Summary
Qui descriviamo un protocollo di co-immunoprecipitazione per studiare le interazioni proteina-proteina tra proteine endogene nucleari in condizioni di ipossia. Questo metodo è adatto per la dimostrazione delle interazioni tra fattori di trascrizione e co-regolatori trascrizionali all’ipossia.
Abstract
Bassi livelli di ossigeno (ipossia) innescano una serie di risposte adattative con il Hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) che agisce come un regolatore matrice complessa. HIF-1 è costituito da una subunità α ossigeno-regolato di heterodimeric (HIF-1 α) e costitutivamente espresso subunità β (HIF-1 β) noto anche come arilico dell’idrocarburo del recettore nucleare translocator (ARNT), regolazione di geni coinvolti in diversi processi tra cui l’angiogenesi , eritropoiesi e glicolisi. L’identificazione di proteine interagenti HIF-1 è la chiave per la comprensione dell’ipossia via di segnalazione. Oltre alla regolazione della stabilità di HIF-1 α, ipossia attiva inoltre la traslocazione nucleare di molti fattori di trascrizione tra cui HIF-1 α e ARNT. In particolare, la maggior parte dei metodi attualmente utilizzati per lo studio di tali interazioni proteina-proteina (PPIs) sono basata su sistemi dove i livelli della proteina sono aumentati artificialmente attraverso la sovraespressione della proteina. Sovraespressione di proteine spesso porta a risultati non-fisiologica derivanti dagli elementi spaziali e temporali. Qui descriviamo una co-immunoprecipitazione modificata a seguito del trattamento di ipossia utilizzando proteine nucleari endogene e come un proof of concept, per mostrare l’interazione tra HIF-1 α e ARNT di protocollo. In questo protocollo, le cellule ipossiche sono state raccolte in condizioni ipossiche e tampone di lavaggio di Dulbecco Phosphate-Buffered Saline (DPBS) era anche pre-equilibrato a condizioni di ipossia prima dell’uso per mitigare la degradazione della proteina o proteina complessa dissociazione durante la riossigenazione. Inoltre, le frazioni nucleari sono stati successivamente estratti per concentrare e stabilizzare le proteine nucleari endogene ed evitare possibili risultati spuri spesso visto durante la sovraespressione della proteina. Questo protocollo consente di dimostrare endogeni e nativi di interazioni tra fattori di trascrizione e co-regolatori trascrizionali in condizioni di ipossia.
Introduction
L’ipossia si verifica quando viene fornito ossigeno insufficiente di cellule e tessuti del corpo. Esso svolge un ruolo critico in vari processi fisiologici e patologici, quali il differenziamento di cellule staminali, infiammazione e cancro1,2. Fattori inducibili dall’ipossia (HIFs) fungono da eterodimeri composto di una subunità α ossigeno-regolato e una subunità β costitutivamente espressa anche conosciuto come ARNT3. Tre isoforme della subunità HIF-α (HIF-1 α, HIF-2α e HIF-3 α) e tre subunità HIF-β (ARNT/HIF-1 β, ARNT2 e ARNT3) sono state identificate fino ad oggi. HIF-1 α e ARNT sono espresso ubiquitariamente, considerando che HIF-2α, HIF-3 α, ARNT2 e ARNT3 hanno limitato più espressione modelli4. Il complesso della proteina HIF-1 è il regolatore chiave della risposta ipossia. In condizioni di ipossia HIF-1 α diventa stabilizzato, poi trasloca nel nucleo e dimerizza con ARNT5. Successivamente, questo complesso si lega a specifici nucleotidi conosciuti come elementi reattivi di ipossia (HREs) e regola l’espressione di geni bersaglio coinvolti in diversi processi tra cui l’angiogenesi, eritropoiesi e glicolisi6. Oltre a questa risposta “canonica”, la via di segnalazione di ipossia è noto anche per diafonia con risposta cellulare più vie come tacca e nucleare della fattore-kappa B (NF-κB) di segnalazione7,8,9.
L’identificazione delle proteine interagenti romanzo HIF-1 è importante per una migliore comprensione dell’ipossia via di segnalazione. In contrasto con ARNT, che è insensibile ai livelli di ossigeno e costitutivamente espressa, i livelli della proteina HIF-1 α sono strettamente regolati dai livelli di ossigeno cellulare. Al normoxia (21% di ossigeno), proteine di HIF-1 α sono rapidamente degradata10,11. La breve emivita di HIF-1 α al normoxia presenta sfide tecniche specifiche per la rilevazione della proteina da estratti cellulari, così come per l’identificazione di proteine che interagiscono HIF-1 α. Inoltre, diversi fattori di trascrizione, compresi quelli del complesso HIF-1 traslocano nel nucleo sotto condizioni di ipossia12,13,14. La maggior parte dei metodi attualmente utilizzati per studi di PPI sono eseguita usando non-fisiologica iperespressione delle proteine. Tale sovraespressione della proteina è stata segnalata per causare difetti cellulari differenti attraverso i meccanismi multipli compreso sovraccarico delle risorse, squilibrio stechiometrico, interazioni promiscue e via modulazione15,16. In termini di studi PPI, sovraespressione della proteina può portare a falsi negativi positivi, o addirittura falsi, risultati a seconda delle proprietà della proteina e le funzioni delle proteine overexpressed. Pertanto, i metodi attuali per gli studi di PPI necessario essere modificato al fine di rivelare la PPIs fisiologicamente rilevanti in condizioni ipossiche. Precedentemente abbiamo dimostrato l’interazione tra HIF-1 e il fattore di trascrizione famiglia Ets GA-legante della proteina (GABP) in cellule P19 hypoxic, che contribuisce alla risposta del promotore Hes1 a ipossia17. Qui, descriviamo un protocollo di co-immunoprecipitazione per studiare PPIs tra proteine endogene nucleari in condizioni di ipossia. L’interazione tra HIF-1 α e ARNT è mostrato come un proof of concept. Questo protocollo è adatto per la dimostrazione delle interazioni tra fattori di trascrizione e co-regolatori trascrizionali in condizioni di ipossia, compresi ma non limitati all’identificazione di proteine interagenti HIF-1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il complesso di HIF-1 è un regolatore dell’omeostasi dell’ossigeno cellulare e regola una pletora di geni coinvolti in diverse risposte adattative cellulari all’ipossia. Identificazione di nuove proteine interagenti di HIF-1 è importante per la comprensione della trasduzione del segnale ipossico. Esperimenti di co-immunoprecipitazione comunemente utilizzati per studi di PPIs per delineare vie di trasduzione del segnale cellulare. Tuttavia, la sovraespressione di proteina è ancora ampiamente usata e questo può portare…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Assoc. Prof. ssa Sin Tiong Ong per l’utilizzo della workstation ipossia. Questo lavoro è stato supportato dal testo seguente: Singapore Ministry of Education, MOE 1T1-02/04 e MOE2015-T2-2-087 (a Y.A.), Lee Kong Chian School of Medicine, Nanyang Technological University avviamento sovvenzione M4230003 (p.o.b.), il Consiglio svedese della ricerca, il Famiglia Erling Persson Foundation, la Fondazione di Novo Nordisk, l’af di Stichting Jochnick Foundation, l’associazione svedese di diabete, la compagnia di assicurazione di Scandia, la ricerca sul diabete e Wellness Foundation, Fondazione di ormeggio von Kantzow, il Programma di ricerca strategico nel diabete al Karolinska Institutet, l’ERC ERC-2013-AdG 338936-Betalmage e Knut e Alice Wallenberg Foundation.
Materials
| Material | |||
| 1.0 M Tris-HCl Buffer, pH 7.4 | 1st BASE | 1415 | |
| Protein A/G Sepharose beads | Abcam | ab193262 | |
| Natural Mouse IgG protein | Abcam | ab198772 | |
| EDTA | Bio-Rad | 1610729 | |
| 2x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610737 | |
| 2-Mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610710 | |
| Nitrocellulose Membrane | Bio-Rad | 1620112 | |
| Blotting-Grade Blocker | Bio-Rad | 1706404 | Non-fat dry milk for western blotting applications |
| 10x Tris Buffered Saline (TBS) | Bio-Rad | 1706435 | |
| 10% Tween 20 | Bio-Rad | 1610781 | |
| 10x Tris/Glycine/SDS | Bio-Rad | 1610732 | |
| 10x Tris/Glycine Buffer | Bio-Rad | 1610771 | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio-Rad | 1610374 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7074 | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7076 | |
| SignalFire ECL Reagent | Cell Signaling | 6883 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Corning | 21-030-CV | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Merck Millipore | 52332 | |
| ARNT/HIF-1 beta Antibody | Novus Biologicals | NB100-124 | Concentration: 1.4 mg/mL |
| HIF-1 alpha Antibody | Novus Biologicals | NB100-479 | Concentration: 1.0 mg/mL |
| YY1 Antibody | Novus Biologicals | NBP1-46218 | Concentration: 0.2 mg/mL |
| Qproteome Nuclear Protein Kit | Qiagen | 37582 | Lysis buffer NL and Extraction Buffer NX1 are provied in the kit |
| GAPDH Antibody | Santa Cruz | sc-47724 | Concentration: 0.2 mg/mL |
| Glycerol (≥99%) | Sigma | G5516 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| RIPA buffer | Sigma | R0278 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | 71376 | |
| NP-40 | Sigma | 127087-87-0 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM, 4.5 g/L glucose) | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher Scientific | R0861 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10270106 | |
| HEK293A cell line | Thermo Fisher Scientific | R70507 | |
| Methanol | Thermo Fisher Scientific | 67-56-1 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Pierce Protease Inhibitor Tablets | Thermo Fisher Scientific | 88660 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| QSP gel loading tip | Thermo Fisher Scientific | QSP#010-R204-Q-PK | 1-200 uL |
| Equipment/Instrument | |||
| Thick Blot Filter Paper, Precut, 7.5 x 10 cm | Bio-Rad | 1703932 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, with Mini Trans-Blot Module and PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1658034 | |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | Bio-Rad | 4561083 | |
| ChemiDoc XRS+ System | Bio-Rad | 1708265 | |
| I-Glove | BioSpherix | I-Glove | |
| Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader | BioTek | BTS1LFTA | |
| Costar 5mL Stripette Serological Pipets | Corning | 4487 | |
| Costar 10mL Stripette Serological Pipets | Corning | 4488 | |
| Costar 25mL Stripette Serological Pipets | Corning | 4251 | |
| Corning 96-Well Clear Bottom Black Polystyrene Microplates | Corning | 3631 | |
| 15mL High Clarity PP conical Centrifuge Tubes | Corning | 352095 | |
| Small Cell Scraper | Corning | 3010 | |
| Gilson Pipetman L 4-pipettes kit | Gilson | F167370 | P2, P20, P200, P1000 and accessories |
| 1.5mL Polypropylene Microcentrifuge Tubes | Greiner Bio-One | 616201 | |
| PIPETBOY acu 2 Pipettor | INTEGRA Biosciences | 155 000 | |
| Justrite Flammable Liquid Storage Cabinets | Justrite Manufacturing Co. | 896000 | |
| Vortex mixer | Labnet | S0200 | |
| CO2 incubator | NuAire | NU-5820 | |
| Orbital shakers | Stuart | SSL1 | |
| Tube rotator SB3 | Stuart | SB3 | |
| MicroCL 21R Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002470 | |
| Sorvall ST 16 Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004240 | |
| Tissue Culture Dishes (100 mm) | Thermo Fisher Scientific | 150350 | |
| Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device | Thermo Fisher Scientific | 69580 | 10K MWCO, 0.1 mL |
| Float Buoys for 0.1mL Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Devices | Thermo Fisher Scientific | 69588 | |
| LSE Digital Dry Bath Heaters | Thermo Fisher Scientific | 1168H25 | |
| Thermo Scientific 1300 Series A2 Class II, Type A2 Bio Safety Cabinets | Thermo Fisher Scientific | 13-261-308 | |
| Software | |||
| Image Lab Software | Bio-Rad | 1709691 |
References
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