Co-Immunopräzipitation Assay mit endogenen nuklearen Proteinen aus Zellen kultiviert unter hypoxischen Bedingungen
Summary
Hier beschreiben wir ein co-Immunopräzipitation-Protokoll, um Protein-Protein-Interaktionen zwischen endogenen nuklearen Proteine unter hypoxischen Bedingungen zu studieren. Diese Methode eignet sich zur Demonstration der Wechselwirkungen zwischen Transkriptionsfaktoren und transkriptionelle Co Regulierungsbehörden auf Hypoxie.
Abstract
Niedrige Sauerstoffsättigung (Hypoxie) lösen eine Vielzahl von adaptive Reaktionen mit Hypoxie-induzierbaren Faktors Komplex als ein master Regler 1 (HIF-1). HIF-1 besteht aus einem heterodimerisierenden Sauerstoff reguliert α Untereinheit (HIF-1α) und konstitutiv ausgedrückt β-Untereinheit (HIF-1β) auch bekannt als Aryl Hydrocarbon-Rezeptor nuklearen Nyrianer (ARNT), Regulierung von Genen, die in unterschiedlichen Prozessen einschließlich Angiogenese , Erythropoese und Glykolyse. Die Identifizierung von HIF-1 interagierenden Proteine ist Schlüssel zum Verständnis der Hypoxie Signalweg. Neben der Regelung von HIF-1α Stabilität löst Hypoxie auch die nukleare Translokation von vielen Transkriptionsfaktoren einschließlich HIF-1α und ARNT. Bemerkenswert ist, basieren die meisten aktuellen Methoden zur Untersuchung solcher Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPI) auf Systemen, wo proteingehalte durch Protein-Überexpression künstlich erhöht werden. Protein-Überexpression oft führt zu unphysiologischen Ergebnisse aus zeitlichen und räumlichen Artefakte. Hier beschreiben wir eine modifizierte co-Immunopräzipitation Protokoll nach Hypoxie Behandlung mit endogenen nuklearen Proteine und als ein Proof of Concept, das Zusammenspiel von HIF-1α und ARNT zu zeigen. In diesem Protokoll die hypoxischen Zellen unter hypoxischen Bedingungen geerntet wurden und die Dulbecco Phosphate-Buffered Kochsalzlösung (DPBS) Waschpuffer war auch vorab äquilibriert hypoxischen Bedingungen vor der Benutzung zum Proteinabbau oder Proteinkomplex mindern Dissoziation in flussbettfilters. Darüber hinaus waren die nuklearen Fraktionen anschließend extrahiert, um konzentrieren und endogenen nuklearen Proteine stabilisieren und vermeiden mögliche falsche Ergebnisse oft während Protein Überexpression gesehen. Dieses Protokoll kann zur endogene und native Interaktionen zwischen Transkriptionsfaktoren und transkriptionelle Co Regulierungsbehörden unter hypoxischen Bedingungen zu demonstrieren.
Introduction
Hypoxie tritt auf, wenn die Zellen und Geweben des Körpers nicht ausreichend Sauerstoff zugeführt wird. Es spielt eine entscheidende Rolle in verschiedenen physiologischen und pathologischen Prozessen wie stammzelldifferenzierung, Entzündungen und Krebs1,2. Hypoxie-induzierbaren Faktoren (HIFs) fungieren als Heterodimere bestehend aus einem Sauerstoff-regulierten α-Untereinheit und einer konstitutiv exprimierten β-Untereinheit auch bekannt als ARNT3. Bis heute wurden drei Isoformen von HIF-α-Untereinheiten (HIF-1α, HIF-2α und HIF-3α) und drei HIF-β-Untereinheiten (ARNT/HIF-1β, ARNT2 und ARNT3) identifiziert. HIF-1α und ARNT sind ubiquitär ausgedrückt, während HIF-2α, HIF-3α, ARNT2 und ARNT3 mehr Ausdruck Muster4eingeschränkt haben. Die HIF-1-Protein-Komplex ist der zentrale Regler der Hypoxie Antwort. Unter hypoxischen Bedingungen HIF-1α stabilisiert wird, dann translocates in den Zellkern und dimerizes mit ARNT5. Anschließend dieser Komplex bindet an spezifische Nukleotide bekannt als Hypoxie reagiert Elemente (HREs) und den Ausdruck der Zielgene in vielfältigen Prozesse einschließlich der Angiogenese, Erythropoese und Glykolyse6regelt. Neben dieser “kanonisch” Reaktion, die Hypoxie-Signalweg ist auch bekannt, Übersprechen mit mehreren zelluläre Reaktion Signalwege wie Notch und Nuclear Factor-Kappa B (NF-κB)7,8,9.
Die Identifizierung von interagierenden Proteine Roman HIF-1 ist wichtig für ein besseres Verständnis für die Hypoxie Signalweg. Im Gegensatz zu ARNT, ist unempfindlich gegenüber Sauerstoff-Niveaus und konstitutiv exprimierten sind HIF-1α proteingehalte zellulären Sauerstoff-Niveaus fest geregelt. Bei normoxiezustand (21 % Sauerstoff) sind Proteine, HIF-1α stark degradierten10,11. Die kurze Halbwertszeit von HIF-1α am normoxiezustand präsentiert spezielle technische Herausforderungen für die Erkennung des Proteins aus Zelle Extrakten sowie für die Identifizierung von HIF-1α-wechselwirkenden Proteinen. Darüber hinaus translozieren mehrere Transkriptionsfaktoren, einschließlich derjenigen der HIF-1-Komplex in den Zellkern unter hypoxischen Bedingungen12,13,14. Die meisten der aktuellen Methoden für die PPI-Studien werden mit unphysiologischen Überexpression von Proteinen durchgeführt. Diese Protein-Überexpression wurde berichtet, zu verschiedenen zellulären defekten durch mehrere Mechanismen, einschließlich des Ressource-Überladung, stöchiometrischen Ungleichgewicht und promiscuous Interaktionen Weg Modulation15,16. In Bezug auf PPI Studien kann Protein Überexpression zu falsch positive oder sogar falsch Negative Ergebnisse je nach Protein Eigenschaften und der Funktionsweise der überexprimieren Proteine führen. Die aktuellen Methoden zur PPI Studien müssen daher geändert werden, um die physiologisch relevanten ppi unter hypoxischen Bedingungen zu offenbaren. Zuvor haben wir bewiesen, dass die Interaktion zwischen HIF-1 und Ets Familie Transkriptionsfaktors GA-bindeprotein (GABP) in hypoxischen P19 Zellen, die für die Reaktion des Hes1 -Promotors auf Hypoxie17beiträgt. Hier beschreiben wir ein co-Immunopräzipitation Protokoll zur ppi zwischen endogenen nuklearen Proteine unter hypoxischen Bedingungen zu studieren. Das Zusammenspiel von HIF-1α und ARNT erscheint als ein Proof of Concept. Dieses Protokoll eignet sich für den Nachweis der Interaktionen zwischen Transkriptionsfaktoren und transkriptionelle Co Regulatoren unter hypoxischen Bedingungen, einschließlich aber nicht beschränkt auf die Identifizierung von HIF-1 interagierenden Proteine.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der HIF-1-Komplex ist ein master Regulator der zellulären Sauerstoff Homöostase und regelt eine Vielzahl von Genen, die in verschiedenen zellulären adaptive Reaktionen auf Hypoxie. Identifizierung von neuen HIF-1 interagierenden Proteine ist wichtig für das Verständnis der hypoxischen Signaltransduktion. Co-Immunopräzipitation Experimente werden häufig für ppi Studien verwendet, um zelluläre Signalwege Transduktion zu umreißen. Allerdings Protein Überexpression ist immer noch weit verbreitet und dies kann zu e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Prof. Assoc. Sin Tiong Ong für die Nutzung der Hypoxie-Workstation. Diese Arbeit wurde unterstützt durch die folgenden: Singapore Ministry of Education, MOE 1T1-02/04 und MOE2015-T2-2-087 (, Y.A), Lee Kong Chian School of Medicine, Nanyang Technological University Gründungshilfe M4230003 (um Sokolov), der schwedischen Forschungsrat der Erling Persson Familienstiftung, die Novo Nordisk Stiftung, die Stichting af Jochnick Foundation, die schwedische Diabetes Association, Scandia-Versicherungs-Gesellschaft, der Diabetes-Forschung und Wellness, Liegeplatz von Kantzow Stiftung, die Strategische Forschungsprogramm bei Diabetes am Karolinska Institutet, der ERC ERC-2013-AdG-338936-Betalmage, und Knut und Alice Wallenberg Foundation.
Materials
| Material | |||
| 1.0 M Tris-HCl Buffer, pH 7.4 | 1st BASE | 1415 | |
| Protein A/G Sepharose beads | Abcam | ab193262 | |
| Natural Mouse IgG protein | Abcam | ab198772 | |
| EDTA | Bio-Rad | 1610729 | |
| 2x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610737 | |
| 2-Mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610710 | |
| Nitrocellulose Membrane | Bio-Rad | 1620112 | |
| Blotting-Grade Blocker | Bio-Rad | 1706404 | Non-fat dry milk for western blotting applications |
| 10x Tris Buffered Saline (TBS) | Bio-Rad | 1706435 | |
| 10% Tween 20 | Bio-Rad | 1610781 | |
| 10x Tris/Glycine/SDS | Bio-Rad | 1610732 | |
| 10x Tris/Glycine Buffer | Bio-Rad | 1610771 | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio-Rad | 1610374 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7074 | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7076 | |
| SignalFire ECL Reagent | Cell Signaling | 6883 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Corning | 21-030-CV | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Merck Millipore | 52332 | |
| ARNT/HIF-1 beta Antibody | Novus Biologicals | NB100-124 | Concentration: 1.4 mg/mL |
| HIF-1 alpha Antibody | Novus Biologicals | NB100-479 | Concentration: 1.0 mg/mL |
| YY1 Antibody | Novus Biologicals | NBP1-46218 | Concentration: 0.2 mg/mL |
| Qproteome Nuclear Protein Kit | Qiagen | 37582 | Lysis buffer NL and Extraction Buffer NX1 are provied in the kit |
| GAPDH Antibody | Santa Cruz | sc-47724 | Concentration: 0.2 mg/mL |
| Glycerol (≥99%) | Sigma | G5516 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| RIPA buffer | Sigma | R0278 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | 71376 | |
| NP-40 | Sigma | 127087-87-0 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM, 4.5 g/L glucose) | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher Scientific | R0861 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10270106 | |
| HEK293A cell line | Thermo Fisher Scientific | R70507 | |
| Methanol | Thermo Fisher Scientific | 67-56-1 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Pierce Protease Inhibitor Tablets | Thermo Fisher Scientific | 88660 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| QSP gel loading tip | Thermo Fisher Scientific | QSP#010-R204-Q-PK | 1-200 uL |
| Equipment/Instrument | |||
| Thick Blot Filter Paper, Precut, 7.5 x 10 cm | Bio-Rad | 1703932 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, with Mini Trans-Blot Module and PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1658034 | |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | Bio-Rad | 4561083 | |
| ChemiDoc XRS+ System | Bio-Rad | 1708265 | |
| I-Glove | BioSpherix | I-Glove | |
| Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader | BioTek | BTS1LFTA | |
| Costar 5mL Stripette Serological Pipets | Corning | 4487 | |
| Costar 10mL Stripette Serological Pipets | Corning | 4488 | |
| Costar 25mL Stripette Serological Pipets | Corning | 4251 | |
| Corning 96-Well Clear Bottom Black Polystyrene Microplates | Corning | 3631 | |
| 15mL High Clarity PP conical Centrifuge Tubes | Corning | 352095 | |
| Small Cell Scraper | Corning | 3010 | |
| Gilson Pipetman L 4-pipettes kit | Gilson | F167370 | P2, P20, P200, P1000 and accessories |
| 1.5mL Polypropylene Microcentrifuge Tubes | Greiner Bio-One | 616201 | |
| PIPETBOY acu 2 Pipettor | INTEGRA Biosciences | 155 000 | |
| Justrite Flammable Liquid Storage Cabinets | Justrite Manufacturing Co. | 896000 | |
| Vortex mixer | Labnet | S0200 | |
| CO2 incubator | NuAire | NU-5820 | |
| Orbital shakers | Stuart | SSL1 | |
| Tube rotator SB3 | Stuart | SB3 | |
| MicroCL 21R Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002470 | |
| Sorvall ST 16 Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004240 | |
| Tissue Culture Dishes (100 mm) | Thermo Fisher Scientific | 150350 | |
| Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device | Thermo Fisher Scientific | 69580 | 10K MWCO, 0.1 mL |
| Float Buoys for 0.1mL Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Devices | Thermo Fisher Scientific | 69588 | |
| LSE Digital Dry Bath Heaters | Thermo Fisher Scientific | 1168H25 | |
| Thermo Scientific 1300 Series A2 Class II, Type A2 Bio Safety Cabinets | Thermo Fisher Scientific | 13-261-308 | |
| Software | |||
| Image Lab Software | Bio-Rad | 1709691 |
References
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