Co-immunoprecipitation Assay באמצעות חלבונים גרעיניים אנדוגני מתאי תרבותי בתנאים ובשפתיים
Summary
כאן נתאר פרוטוקול co-immunoprecipitation ללמוד אינטראקציות חלבון בין חלבונים גרעיניים אנדוגני בתנאים ובשפתיים. שיטה זו מתאימה הפגנה של אינטראקציות בין גורמי שעתוק גנים ברמת השעתוק הרגולטורים שותף ב היפוקסיה.
Abstract
רמות חמצן נמוכות (היפוקסיה) לעורר מגוון תגובות מסתגלת עם הגורם היפוקסיה-inducible 1 (HIF-1) מורכבים מתנהג כמו הרגולטור הראשי. HIF-1 כוללת יחידת משנה α מוסדר חמצן heterodimeric (HIF-1α) והביע צורונים β יחידה משנית (HIF-1β) הידוע גם בשם aryl פחמימן קולטן הגרעין translocator (ARNT), ויסות גנים המעורבים בתהליכים מגוונים כולל אנגיוגנזה , אריתרופויזה, גליקוליזה. זיהוי חלבונים שמעצבת HIF-1 היא המפתח להבנת היפוקסיה איתות. מלבד ויסות HIF-1α יציבות, היפוקסיה מפעיל גם רוברטסונית הגרעין של גורמי שעתוק רבים כולל HIF-1α ו- ARNT. ראוי לציין, מרבית השיטות הנוכחיות המשמשות ללימוד כזה אינטראקציות חלבון-חלבון (להדברה) מבוססים על מערכות שבו רמות החלבון גדלו באופן מלאכותי באמצעות ביטוי חלבון. ביטוי חלבון לעיתים קרובות מובילה לתוצאות-פיזיולוגיים הנובעים חפצים הגיאופוליטיות והמרחביות טמפורלית. כאן נתאר co-immunoprecipitation שונה של פרוטוקול בעקבות טיפול היפוקסיה באמצעות חלבונים גרעיניים אנדוגני, וכהוכחה של המושג, כדי להציג את האינטראקציה בין HIF-1α ARNT. פרוטוקול זה, התאים ובשפתיים נבצרו בתנאים שתקבעו, מאגר שטיפת מלוחים Phosphate-Buffered (DPBS) של Dulbecco היה גם מראש equilibrated לתנאים ובשפתיים לפני השימוש כדי להמתיק חלבון השפלה או החלבונים דיסוציאציה במהלך reoxygenation. בנוסף, שברים גרעיני חולצו לאחר מכן להתרכז, ייצוב חלבונים גרעיניים אנדוגני, להימנע מתוצאות כדין ניתן לראות לעיתים קרובות במהלך ביטוי חלבון. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי להדגים אנדוגני, יליד האינטראקציות בין גורמי שעתוק, תעתיק שיתוף הרגולטורים בתנאים ובשפתיים.
Introduction
היפוקסיה מתרחשת כאשר חמצן לקוי מסופקים של תאים ורקמות של הגוף. זה ממלא תפקיד קריטי תהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים כגון התמיינות תאי גזע, דלקת סרטן1,2. היפוקסיה-inducible גורמים (לשתול) לפעול heterodimers מורכב של יחידת משנה של α מוסדר חמצן של יחידת משנה של β צורונים ביטוי ידוע גם ARNT3. שלושה איזופורמים של subunits HIF-α (HIF-1α, HIF-2α ו- HIF-3α), שלושה subunits HIF-β (ARNT/HIF-1β, ARNT2 ו- ARNT3) זוהו עד כה. HIF-1α ו- ARNT ubiquitously מבוטאים, ואילו HIF-2α, HIF-3α, ARNT2, ARNT3 שיש יותר מוגבלת דפוסי ביטוי4. החלבונים HIF-1 הוא המתקן מפתח של התגובה היפוקסיה. בתנאים שתקבעו, HIF-1α הופך התייצב, ואז translocates את הגרעין, dimerizes עם ARNT5. לאחר מכן, מתחם זה נקשר נוקלאוטידים ספציפיים המכונה רכיבי מגיב היפוקסיה (HREs), מסדיר את הביטוי של היעד גנים המעורבים בתהליכים מגוונים כולל אנגיוגנזה, אריתרופויזה, גליקוליזה6. בנוסף תגובה זו “קנונית”, מסלול איתות היפוקסיה ידוע גם crosstalk עם תגובת תאי מרובים איתות משעולים כגון חריץ גרעיני גורם-kappa B (NF-κB)7,8,9.
זיהוי חלבונים שמעצבת את הרומן HIF-1 חשוב להבין טוב יותר היפוקסיה איתות. בניגוד ARNT, אשר הוא רגישות רמות החמצן צורונים ביטוי, רמות חלבון HIF-1α מוסדרים בחוזקה על ידי רמות החמצן הסלולר. Normoxia (21% חמצן), חלבונים HIF-1α הם מפורק במהירות10,11. מחצית החיים הקצר של HIF-1α-normoxia מציג אתגרים טכניים ספציפיים עבור זיהוי החלבון מן התא תמציות, כמו גם לצורך זיהוי חלבונים HIF-1α-אינטראקציה. יתר על כן, מספר גורמי שעתוק, כולל אלה של המתחם HIF-1 translocate לתוך הגרעין תחת תנאים ובשפתיים12,13,14. רוב השיטות הנוכחי המשמש ללימודי PPI מבוצעות באמצעות ביטוי-פיזיולוגיים של חלבונים. ביטוי חלבון כזה דווח כדי לגרום למומים הסלולר שונים באמצעות מנגנונים מרובים כולל עומס יתר של משאבים, חוסר איזון stoichiometric, אינטראקציות מופקרת של מסלול אפנון15,16. מבחינת לימודי PPI, ביטוי חלבון יכול להוביל שלילי חיובי, או אפילו שקר שקר, תוצאות בהתאם החלבון המאפיינים והפונקציות של חלבונים overexpressed. לכן, השיטות ללימודי PPI חייב להיות שונה על מנת לחשוף את להדברה רלוונטי מבחינה פיזיולוגית בתנאים ובשפתיים. בעבר הראו את האינטראקציה בין HIF-1 גורם שעתוק משפחה של Ets GA מחייב חלבון (GABP) בתאי P19 מחוסר חמצן, אשר תורמת התגובה של האמרגן Hes1 היפוקסיה17. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול co-immunoprecipitation ללמוד להדברה בין חלבונים גרעיניים אנדוגני בתנאים ובשפתיים. האינטראקציה בין HIF-1α ו- ARNT מוצג בתור הוכחה של המושג. פרוטוקול זה מתאים הממחיש את האינטראקציות בין גורמי שעתוק גנים ברמת השעתוק הרגולטורים לעבודה בתנאים שתקבעו, לרבות אך לא רק לזיהוי של חלבונים שמעצבת HIF-1.
Protocol
Representative Results
Discussion
המתחם HIF-1 הוא מווסת הבסיס של חמצן הסלולר הומאוסטזיס ומסדיר שפע של גנים המעורבים שונים התגובות היפוקסיה מסתגלת הסלולר. זיהוי של הרומן HIF-1 שמעצבת חלבונים חשוב להבנה של אותות ובשפתיים. Co-immunoprecipitation ניסויים משמשים בדרך כלל ללימודי להדברה להתוות מסלולים התמרה חושית אות סלולרי. עם זאת, ביטוי חלב…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים פרופ ‘ / ח’ חטא Tiong אונג לשימוש של תחנת העבודה היפוקסיה. עבודה זו נתמכה על ידי הבאות: סינגפור משרד החינוך, מו 1T1-02/04, MOE2015-T2-2-087 (כדי דיאגנוסטיקה), לי קונג Chian בית הספר לרפואה, אוניברסיטת הטכנולוגי Nanyang סטארט-אפ מענק M4230003 (ת. ד.), המועצה למחקר השבדי, קרן משפחת ארלינג-פרסון, קרן נובו נורדיסק, את af Stichting Jochnick קרן, האגודה לסוכרת שוודית, חברת הביטוח Scandia, במחקר הסוכרת, בריאות קרן, הקרן של דרגש פון Kantzow, תוכנית מחקר אסטרטגי סוכרת-Institutet קרולינסקה, ERC ERC-2013-AdG 338936-Betalmage, ואת קנוט אליס ולנברג קרן.
Materials
| Material | |||
| 1.0 M Tris-HCl Buffer, pH 7.4 | 1st BASE | 1415 | |
| Protein A/G Sepharose beads | Abcam | ab193262 | |
| Natural Mouse IgG protein | Abcam | ab198772 | |
| EDTA | Bio-Rad | 1610729 | |
| 2x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610737 | |
| 2-Mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610710 | |
| Nitrocellulose Membrane | Bio-Rad | 1620112 | |
| Blotting-Grade Blocker | Bio-Rad | 1706404 | Non-fat dry milk for western blotting applications |
| 10x Tris Buffered Saline (TBS) | Bio-Rad | 1706435 | |
| 10% Tween 20 | Bio-Rad | 1610781 | |
| 10x Tris/Glycine/SDS | Bio-Rad | 1610732 | |
| 10x Tris/Glycine Buffer | Bio-Rad | 1610771 | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio-Rad | 1610374 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7074 | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7076 | |
| SignalFire ECL Reagent | Cell Signaling | 6883 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Corning | 21-030-CV | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Merck Millipore | 52332 | |
| ARNT/HIF-1 beta Antibody | Novus Biologicals | NB100-124 | Concentration: 1.4 mg/mL |
| HIF-1 alpha Antibody | Novus Biologicals | NB100-479 | Concentration: 1.0 mg/mL |
| YY1 Antibody | Novus Biologicals | NBP1-46218 | Concentration: 0.2 mg/mL |
| Qproteome Nuclear Protein Kit | Qiagen | 37582 | Lysis buffer NL and Extraction Buffer NX1 are provied in the kit |
| GAPDH Antibody | Santa Cruz | sc-47724 | Concentration: 0.2 mg/mL |
| Glycerol (≥99%) | Sigma | G5516 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| RIPA buffer | Sigma | R0278 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | 71376 | |
| NP-40 | Sigma | 127087-87-0 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM, 4.5 g/L glucose) | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher Scientific | R0861 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10270106 | |
| HEK293A cell line | Thermo Fisher Scientific | R70507 | |
| Methanol | Thermo Fisher Scientific | 67-56-1 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Pierce Protease Inhibitor Tablets | Thermo Fisher Scientific | 88660 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| QSP gel loading tip | Thermo Fisher Scientific | QSP#010-R204-Q-PK | 1-200 uL |
| Equipment/Instrument | |||
| Thick Blot Filter Paper, Precut, 7.5 x 10 cm | Bio-Rad | 1703932 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, with Mini Trans-Blot Module and PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1658034 | |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | Bio-Rad | 4561083 | |
| ChemiDoc XRS+ System | Bio-Rad | 1708265 | |
| I-Glove | BioSpherix | I-Glove | |
| Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader | BioTek | BTS1LFTA | |
| Costar 5mL Stripette Serological Pipets | Corning | 4487 | |
| Costar 10mL Stripette Serological Pipets | Corning | 4488 | |
| Costar 25mL Stripette Serological Pipets | Corning | 4251 | |
| Corning 96-Well Clear Bottom Black Polystyrene Microplates | Corning | 3631 | |
| 15mL High Clarity PP conical Centrifuge Tubes | Corning | 352095 | |
| Small Cell Scraper | Corning | 3010 | |
| Gilson Pipetman L 4-pipettes kit | Gilson | F167370 | P2, P20, P200, P1000 and accessories |
| 1.5mL Polypropylene Microcentrifuge Tubes | Greiner Bio-One | 616201 | |
| PIPETBOY acu 2 Pipettor | INTEGRA Biosciences | 155 000 | |
| Justrite Flammable Liquid Storage Cabinets | Justrite Manufacturing Co. | 896000 | |
| Vortex mixer | Labnet | S0200 | |
| CO2 incubator | NuAire | NU-5820 | |
| Orbital shakers | Stuart | SSL1 | |
| Tube rotator SB3 | Stuart | SB3 | |
| MicroCL 21R Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002470 | |
| Sorvall ST 16 Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004240 | |
| Tissue Culture Dishes (100 mm) | Thermo Fisher Scientific | 150350 | |
| Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device | Thermo Fisher Scientific | 69580 | 10K MWCO, 0.1 mL |
| Float Buoys for 0.1mL Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Devices | Thermo Fisher Scientific | 69588 | |
| LSE Digital Dry Bath Heaters | Thermo Fisher Scientific | 1168H25 | |
| Thermo Scientific 1300 Series A2 Class II, Type A2 Bio Safety Cabinets | Thermo Fisher Scientific | 13-261-308 | |
| Software | |||
| Image Lab Software | Bio-Rad | 1709691 |
References
- Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factors in physiology and medicine. Cell. 148 (3), 399-408 (2012).
- Bartels, K., Grenz, A., Eltzschig, H. K. Hypoxia and inflammation are two sides of the same coin. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (46), 18351-18352 (2013).
- Jiang, B. H., Rue, E., Wang, G. L., Roe, R., Semenza, G. L. Dimerization, DNA binding, and transactivation properties of hypoxia-inducible factor 1. J Biol Chem. 271 (30), 17771-17778 (1996).
- Semenza, G. L. HIF-1: mediator of physiological and pathophysiological responses to hypoxia. J Appl Physiol. 88 (4), 1474-1480 (2000).
- Kallio, P. J., et al. Signal transduction in hypoxic cells: Inducible nuclear translocation and recruitment of the CBP/p300 coactivator by the hypoxia-inducible factor-1alpha. EMBO J. 17 (22), 6573-6586 (1998).
- Ke, Q., Costa, M. Hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1). Mol Pharmacol. 70 (5), 1469-1480 (2006).
- Gustafsson, M. V., et al. Hypoxia requires notch signaling to maintain the undifferentiated cell state. Dev Cell. 9 (5), 617-628 (2005).
- Zheng, X., et al. Interaction with factor inhibiting HIF-1 defines an additional mode of cross-coupling between the Notch and hypoxia signaling pathways. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3368-3373 (2008).
- D’Ignazio, L., Bandarra, D., Rocha, S. NF-kappaB and HIF crosstalk in immune responses. FEBS J. 283 (3), 413-424 (2016).
- Wang, G. L., Jiang, B. H., Rue, E. A., Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular O2 tension. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (12), 5510-5514 (1995).
- Zheng, X., et al. Cell-type-specific regulation of degradation of hypoxia-inducible factor 1 alpha: Role of subcellular compartmentalization. Mol Cell Biol. 26 (12), 4628-4641 (2006).
- Depping, R., et al. Nuclear translocation of hypoxia-inducible factors (HIFs): involvement of the classical importin alpha/beta pathway. Biochim Biophys Acta. 1783 (3), 394-404 (2008).
- Wei, H., et al. Hypoxia induces oncogene yes-associated protein 1 nuclear translocation to promote pancreatic ductal adenocarcinoma invasion via epithelial-mesenchymal transition. Tumour Biol. 39 (5), (2017).
- Chang, H. Y., et al. Hypoxia promotes nuclear translocation and transcriptional function in the oncogenic tyrosine kinase RON. Cancer Res. 74 (16), 4549-4562 (2014).
- Moriya, H. Quantitative nature of overexpression experiments. Mol Biol Cell. 26 (22), 3932-3939 (2015).
- Prelich, G. Gene overexpression: Uses, mechanisms, and interpretation. Genetics. 190 (3), 841-854 (2012).
- Zheng, X., et al. A Notch-independent mechanism contributes to the induction of Hes1 gene expression in response to hypoxia in P19 cells. Exp Cell Res. 358 (2), 129-139 (2017).
- Farris, M. H., Ford, K. A., Doyle, R. C. Qualitative and quantitative assays for detection and characterization of protein antimicrobials. J Vis Exp. (110), e53819 (2016).
- Chilov, D., et al. Induction and nuclear translocation of hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1): heterodimerization with ARNT is not necessary for nuclear accumulation of HIF-1alpha. J Cell Sci. 112 (Pt 8), 1203-1212 (1999).
- Yin, S., et al. Arylsulfonamide KCN1 inhibits in vivo glioma growth and interferes with HIF signaling by disrupting HIF-1alpha interaction with cofactors p300/CBP. Clin Cancer Res. 18 (24), 6623-6633 (2012).
- Holmquist-Mengelbier, L., et al. Recruitment of HIF-1alpha and HIF-2alpha to common target genes is differentially regulated in neuroblastoma: HIF-2alpha promotes an aggressive phenotype. Cancer Cell. 10 (5), 413-423 (2006).
- Koh, M. Y., Powis, G. Passing the baton: The HIF switch. Trends Biochem Sci. 37 (9), 364-372 (2012).
- Dumetz, A. C., Snellinger-O’brien, A. M., Kaler, E. W., Lenhoff, A. M. Patterns of protein protein interactions in salt solutions and implications for protein crystallization. Protein Sci. 16 (9), 1867-1877 (2007).
- Graven, K. K., Troxler, R. F., Kornfeld, H., Panchenko, M. V., Farber, H. W. Regulation of endothelial cell glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase expression by hypoxia. J Biol Chem. 269 (39), 24446-24453 (1994).
- Caradec, J., et al. Desperate house genes’: The dramatic example of hypoxia. Br J Cancer. 102 (6), 1037-1043 (2010).
