JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Biology

In Vivo Nanovector levering af en hjerte-specifikke MicroRNA-svamp

Published: June 15, 2018
doi:
10.3791/57845
, ,
1Princess Margaret Cancer Centre,University of Toronto, 2Department of Pathology, Department of Cardiology,Johns Hopkins University

Summary

Væv-specifikke microRNA hæmning er en teknologi, der er underudviklede i feltet microRNA. Heri, beskriver vi en protokol for at kunne hæmme familien miR-181 microRNA i myoblast celler fra hjertet. Nanovector teknologi bruges til at levere en mikroRNA svamp, der viser betydelig i vivo cardio-specifikke miR-181 familie hæmning.

Abstract

MikroRNA (miRNA) er små ikke-kodende RNA, som hæmmer post-transcriptional messenger RNA (mRNA) udtryk. Menneskelige sygdomme som kræft og hjerte-kar-sygdom, har vist sig at aktivere væv og/eller celle-specifikke miRNA udtryk i forbindelse med sygdomsprogression. Hæmning af miRNA udtryk giver mulighed for en terapeutisk intervention. Traditionelle metoder til at hæmme miRNAs, beskæftiger antagomir oligonukleotider, vil dog påvirke specifikke miRNA funktioner ved global levering. Heri, præsenterer vi en protokol for i vivo cardio-specifik hæmning af miR-181 familie i en rotte model. En miRNA-svamp konstruktion er designet til at indeholde 10 gentagne miR-181 bindende sekvenser. Cardio-specifikke α-MHC promotor er klonet i pEGFP rygrad til at drive cardio-specifikke miR-181 miRNA-svamp udtryk. For at skabe en stabil celle er linje at udtrykke miR-181-svamp, myoblast H9c2 celler transfekteret med den α-MHC-EGFP-miR-181-sponge konstruktion og sorteret efter fluorescens-aktiveret celle sortering (FACs) til normal god landbrugspraksis positive H9c2 celler, der er kulturperler med neomycin (G418). Efter en stabil vækst i neomycin, monoklonale cellepopulationer er etableret af yderligere FACs og enkelt celle kloning. De resulterende myoblast H9c2-miR-181-svamp-NGL celler udviser et tab af funktion af miR-181 familiemedlemmer, som vurderes gennem øget udtryk for miR-181 target proteiner og i forhold til H9c2 celler, der udtrykker en scramble ikke-funktionelle svamp. Derudover udvikler vi en nanovector til den systemiske levering af miR-181-svamp konstruktion af kompleksbindende positivt ladede liposomal nanopartikler og negativt ladede miR-181-svamp plasmider. In vivo billeddannelse af normal god landbrugspraksis afslører, at flere hale vene injektioner af en nanovector over en tre-ugers periode er i stand til at fremme en betydelig udtryk af miR-181-svamp i en cardio-specifikke måde. Vigtigere er, er et tab af miR-181 funktion observeret i hjertet væv, men ikke i nyrerne eller leveren. MiRNA-svamp er en kraftfuld metode til at hæmme væv-specifikke miRNA udtryk. Kørsel miRNA-svamp udtryk fra en væv-specifikke promotor giver specificitet for miRNA-hæmning, som kan være begrænset til en målrettet organ eller væv. Derudover tillader kombinerer nanovector og miRNA-svamp teknologier en effektiv levering og væv-specifikke miRNA hæmning i vivo.

Introduction

I de sidste to årtier, har der været talrige undersøgelser, der har peget på den betydningsfulde rolle miRNAs i sygdom hos mennesker. Resultater fra en stor mængde af litteratur viser de ubestridelige betydningen af miRNAs i Patofysiologi af sygdomme såsom kræft1 og hjerte-kar-sygdom2,3,4,5. For eksempel, er miR-21 upregulated i mange kræftformer, hvilket resulterer i en øget cellecyklus og celle spredning6. Hepatitis C infektion, miR-122 spiller en vigtig rolle i replikering af virus7, og det har vist sig at hæmning af miR-122 reducerer virusmængden8. Hjertehypertrofi, miR-212/132 er upregulated i hjertet og er involveret i patologisk fænotype9. Den indlysende betydning af downregulation eller funktionelle hæmning af en upregulated miRNA antyder muligheder for terapeutisk udnytter miRNA biologi i næsten alle sygdomme.

De fire miR-181 familiemedlemmer, miR-181 a/b/c/d, findes i tre genomisk steder i det menneskelige genom. Regionen intronic i et ikke-kodende RNA vært gen (MIR181A1-HG) koder klynge af miR-181-a/b-1. Regionen intronic af NR6A1-genet koder for miR-181-a/b-2. MiR-181-c/d klynge er beliggende i en uncharacterized udskrift på kromosom 19. Alle miR-181 familie medlemmer deler den samme “frø” sekvens og alle fire miR-181 familiemedlemmer kan potentielt regulere de samme mRNA mål.

Vi3,4 og andre10 har fremhævet betydningen af miR-181 familiemedlemmer under slutstadiet hjertesvigt. Vi har også anerkendt, at en miR – 181c Opregulering opstår patologiske betingelser forbundet med en øget risiko for hjertesygdom, såsom type II diabetes, fedme og aldring3,4,5. Det har været postuleret, at overekspression af miR – 181c forårsager oxidativ stress, som fører til et hjerte-dysfunktion4.

Flere grupper har foreslået at miRNA findes i mitokondrierne11,12,13,14, men vi var de første til at påvise, at miR – 181 c er afledt af det nukleare genom, forarbejdet, og efterfølgende omplantes til mitokondrier i RISC3. Desuden har vi fundet en lav udtryk af miR-181a og miR-181b i hjertet5mitokondrie rum. Vigtigere er, har vi fundet at miR – 181c undertrykker mt-COX1 mRNA udtryk, hvilket viser at miRNAs deltage i forordningen mitokondrie gen og ændre mitokondrie funktion3,4.

I denne artikel beskrives den metode, der kræves til at designe en miRNA-svamp til at vælte hele miR-181 familien i cardiomyocytes. Desuden skitsere vi en protokol for programmet på vivo af miR-181-svamp.

Protocol

Alle eksperimentelle procedurer blev godkendt af institutionelle Animal Care og brug Udvalget af Johns Hopkins University. 1. svamp Design MikroRNA bindende 3′ UTRBemærk: A miRNA funktioner gennem specifikke base parring interaktioner med delvist supplerende websteder i den 3′ utranslaterede region (UTR) af dens mål mRNAs (for en omfattende gennemgang, se Bartel)15. Design hæmmere af miRNA udtryk som oligonukleotider, der indeh…

Representative Results

I stabilt transfected pEGFP-miR-181-svamp-udtrykker H9c2 celler (fra trin 4.2), var udtryk for hele miR-181 familien (miR-181a, miR-181b, miR – 181c og miR – 181d) moderat nedsat i forhold til pEGFP-scrambled-udtrykker H9c2 celler. MiR-181-svamp fungerer som en kompetitiv inhibitor af familien hele miR-181, så vi forventede at målrette udtryk af miR – 181c mitokondrie gen, mt-COX1, ville stige. Western blot data tyder på, at mt-COX1 udtryk blev forøget i de pEGFP-miR-181-svamp-udtrykk…

Discussion

I denne artikel beskrives design og syntese af en miRNA-svamp og demonstreret hvordan væv-specifikke udtryk af svampen er et kraftfuldt værktøj til at hæmme væv-specifikke miRNA familie udtryk.

Vi har vist, at en miR-181 familie rettet mod svamp kan klones til et udtryk plasmid med et hjerte-specifikke promotor. Plasmidet kan effektivt pakket ind i en nanovector partikel for levering både in vitro- og i vivo ved hjælp af elektroporation eller en hale vene injektion, he…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker Anthony K. L. Leung Institut for biokemi og molekylær biologi, Bloomberg School of Public Health, Johns Hopkins University for hans tekniske hjælpe med at designe miR-181-svamp konstruktion. Vi takker også Polina Sysa-Shah og Kathleen Gabrielson Institut for molekylær og sammenlignende Pathobiology, Johns Hopkins Medical institutioner for deres tekniske bistand af i vivo billeddannelse leveringssted miRNA-svamp.

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra NIH, HL39752 (til Charles Steenbergen) og af en videnskabsmand udvikling tilskud fra American Heart Association 14SDG18890049 (til Samarjit Das). Rotte cardio-specifikke promotor blev generøst leveret af Jeffery D. Molkentin på Cincinnati children’s Hospital.

Materials

pEGFP-C1 vector Addgene 6084-1
In-fusion Clontech 121416
QIAprep Miniprep Qiagen 27104
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704
miR-181-sponge synthesis Introgen GeneArt custome made
PCR primers Integrated DNA Technologies custome
EcoRI enzymes New Endland Biolabs R0101S
KpnI enzymes New Endland Biolabs R0142S
Rapid DNA Ligation Kit Sigma-Aldrich 11635379001
H9c2 cells ATCC CRL-1446
DMEM Media Thermo Fisher Scientific 11965092
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 10082139
Nucleofector 2b Device Lonza AAB-1001
Nucleofector Kits for H9c2 (2-1) Lonza VCA-1005
G418, Geneticin Thermo Fisher Scientific 11811023
FACSAria II Flow cytometer BD Bioscience 644832
Branson 450 sonifier Marshall Scientific EDP 100-214-239
The Xenogen IVIS Spectrum optical imaging device Caliper Life Sciences
Anti-MTCO1 antibody Abcam ab14705
α-tubulin antibody Abcam ab7291
Sequoia C256 ultrasound system Siemens
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hammond, S. M. microRNA detection comes of age. Nat Methods. 3 (1), 12-13 (2006).
  2. van Rooij, E., Olson, E. N. MicroRNAs: powerful new regulators of heart disease and provocative therapeutic targets. The Journal of Clinical Investigation. 117 (9), 2369-2376 (2007).
  3. Das, S., et al. Nuclear miRNA regulates the mitochondrial genome in the heart. Circulation Research. 110 (12), 1596-1603 (2012).
  4. Das, S., et al. miR-181c regulates the mitochondrial genome, bioenergetics, and propensity for heart failure in vivo. PLoS One. 9 (5), e96820 (2014).
  5. Das, S., et al. Divergent effects of miR-181 family members on myocardial function through protective cytosolic and detrimental mitochondrial microRNA targets. Journal of the American Heart Association. 6 (3), e004694 (2017).
  6. Sicard, F., Gayral, M., Lulka, H., Buscail, L., Cordelier, P. Targeting miR-21 for the therapy of pancreatic cancer. Molecular Therapy. 21 (5), 986-994 (2013).
  7. Jopling, C. L., Yi, M., Lancaster, A. M., Lemon, S. M., Sarnow, P. Modulation of hepatitis C virus RNA abundance by a liver-specific microRNA. Science. 309 (5740), 1577-1581 (2005).
  8. Lanford, R. E., et al. Therapeutic silencing of microRNA-122 in primates with chronic hepatitis C virus infection. Science. 327 (5962), 198-201 (2010).
  9. Ucar, A., et al. The miRNA-212/132 family regulates both cardiac hypertrophy and cardiomyocyte autophagy. Nature Communications. 3, 1078 (2012).
  10. Zhu, X., et al. Identification of micro-RNA networks in end-stage heart failure because of dilated cardiomyopathy. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (9), 1173-1187 (2013).
  11. Bandiera, S., et al. Nuclear outsourcing of RNA interference components to human mitochondria. PLoS One. 6 (6), e20746 (2011).
  12. Barrey, E., et al. Pre-microRNA and mature microRNA in human mitochondria. PLoS One. 6 (5), e20220 (2011).
  13. Bian, Z., et al. Identification of mouse liver mitochondria-associated miRNAs and their potential biological functions. Cell Research. 20 (9), 1076-1078 (2010).
  14. Kren, B. T., et al. MicroRNAs identified in highly purified liver-derived mitochondria may play a role in apoptosis. RNA Biology. 6 (1), 65-72 (2009).
  15. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
  16. Molkentin, J. D., Jobe, S. M., Markham, B. E. Alpha-myosin heavy chain gene regulation: delineation and characterization of the cardiac muscle-specific enhancer and muscle-specific promoter. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 28 (6), 1211-1225 (1996).
  17. Poliseno, L., et al. A coding-independent function of gene and pseudogene mRNAs regulates tumour biology. Nature. 465 (7301), 1033-1038 (2010).
  18. Henao-Mejia, J., et al. The microRNA miR-181 is a critical cellular metabolic rheostat essential for NKT cell ontogenesis and lymphocyte development and homeostasis. Immunity. 38 (5), 984-997 (2013).
  19. Williams, A., Henao-Mejia, J., Harman, C. C., Flavell, R. A. miR-181 and metabolic regulation in the immune system. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 78, 223-230 (2013).
  20. Hori, D., et al. miR-181b regulates vascular stiffness age dependently in part by regulating TGF-beta signaling. PLoS One. 12 (3), e0174108 (2017).
  21. Ebert, M. S., Sharp, P. A. MicroRNA sponges: progress and possibilities. RNA. 16 (11), 2043-2050 (2010).
  22. Ma, L., et al. Therapeutic silencing of miR-10b inhibits metastasis in a mouse mammary tumor model. Nature Biotechnology. 28 (4), 341-347 (2010).
  23. Davis, S., Lollo, B., Freier, S., Esau, C. Improved targeting of miRNA with antisense oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 34 (8), 2294-2304 (2006).
  24. Davis, S., et al. Potent inhibition of microRNA in vivo without degradation. Nucleic Acids Research. 37 (1), 70-77 (2009).
  25. Elmen, J., et al. LNA-mediated microRNA silencing in non-human primates. Nature. 452 (7189), 896-899 (2008).
  26. Esau, C. C. Inhibition of microRNA with antisense oligonucleotides. Methods. 44 (1), 55-60 (2008).
  27. Stenvang, J., Kauppinen, S. MicroRNAs as targets for antisense-based therapeutics. Expert Opinion on Biological Therapy. 8 (1), 59-81 (2008).
  28. Lennox, K. A., Behlke, M. A. A direct comparison of anti-microRNA oligonucleotide potency. Pharmaceutical Research. 27 (9), 1788-1799 (2010).
  29. Lennox, K. A., Behlke, M. A. Chemical modification and design of anti-miRNA oligonucleotides. Gene Therapy. 18 (12), 1111-1120 (2011).
  30. van Rooij, E., Olson, E. N. MicroRNA therapeutics for cardiovascular disease: opportunities and obstacles. Nature Reviews. Drug Discovery. 11 (11), 860-872 (2012).
  31. Stenvang, J., Petri, A., Lindow, M., Obad, S., Kauppinen, S. Inhibition of microRNA function by antimiR oligonucleotides. Silence. 3 (1), 1 (2012).
  32. Levin, A. A. A review of the issues in the pharmacokinetics and toxicology of phosphorothioate antisense oligonucleotides. Biochimica et Biophysica Acta. 1489 (1), 69-84 (1999).
  33. Flynt, A. S., Li, N., Thatcher, E. J., Solnica-Krezel, L., Patton, J. G. Zebrafish miR-214 modulates Hedgehog signaling to specify muscle cell fate. Nature Genetics. 39 (2), 259-263 (2007).
  34. Kloosterman, W. P., Lagendijk, A. K., Ketting, R. F., Moulton, J. D., Plasterk, R. H. Targeted inhibition of miRNA maturation with morpholinos reveals a role for miR-375 in pancreatic islet development. PLoS Biology. 5 (8), e203 (2007).
  35. Martello, G., et al. MicroRNA control of Nodal signalling. Nature. 449 (7159), 183-188 (2007).
  36. Fabani, M. M., Gait, M. J. miR-122 targeting with LNA/2′-O-methyl oligonucleotide mixmers, peptide nucleic acids (PNA), and PNA-peptide conjugates. RNA. 14 (2), 336-346 (2008).
  37. Fabani, M. M., et al. Efficient inhibition of miR-155 function in vivo by peptide nucleic acids. Nucleic Acids Research. 38 (13), 4466-4475 (2010).
  38. Babar, I. A., et al. Nanoparticle-based therapy in an in vivo microRNA-155 (miR-155)-dependent mouse model of lymphoma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), E1695-E1704 (2012).
  39. Torres, A. G., et al. Chemical structure requirements and cellular targeting of microRNA-122 by peptide nucleic acids anti-miRs. Nucleic Acids Research. 40 (5), 2152-2167 (2012).
  40. Kent, O. A., McCall, M. N., Cornish, T. C., Halushka, M. K. Lessons from miR-143/145: the importance of cell-type localization of miRNAs. Nucleic Acids Research. 42 (12), 7528-7538 (2014).

Tags

In VivoNanovectorMicroRNA SpongeHeart-specificMicroRNA KnockdownEGFR PlasmidCMV PromoterAlpha-myosin Heavy Chain PromoterDNA PurificationBacterial TransformationLigation
check_url/57845?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Kent, O. A., Steenbergen, C., Das, S. In Vivo Nanovector Delivery of a Heart-specific MicroRNA-sponge. J. Vis. Exp. (136), e57845, doi:10.3791/57845 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image