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Biology

生体内で心臓特定のマイクロ Rna スポンジの Nanovector 配信

Published: June 15, 2018
doi:
10.3791/57845
, ,
1Princess Margaret Cancer Centre,University of Toronto, 2Department of Pathology, Department of Cardiology,Johns Hopkins University

Summary

組織特異的マイクロ Rna 阻害は、マイクロ Rna において発展途上にある技術です。ここで、正常に心の底から筋細胞のマイクロ Rna ミール 181 家族を阻害するプロトコルについて述べる。Nanovector 技術を使用して、重要な生体内で心臓固有ミール 181 家族阻害を示しますスポンジ、マイクロ Rna を提供します。

Abstract

マイクロ Rna (miRNA) は小さい非コーディングの RNA 転写後のメッセンジャー RNA (mRNA) の発現を抑制します。がんや循環器病などのひと疾患は、組織および/または病気の進行に関連付けられているセル固有の miRNA の表現を有効に示されています。MiRNA の発現の阻害では、治療的介入の可能性を提供しています。ただし、antagomir オリゴヌクレオチドを用いた Mirna を抑制する従来のアプローチは、グローバル配信時に特定のマイクロ Rna の機能を影響します。ここで、ラットのモデル ミール 181 家族の生体内で心臓固有抑制のためのプロトコルを提案する.MiRNA スポンジ構造 10 繰り返しアンチ miR 181 バインド シーケンスを含むように設計されています。心臓固有 α-MHC プロモーターが心臓固有ミール 181 miRNA スポンジ式を運転する pEGFP のバックボーンに複製されます。安定したセルを作成するには、ミール-181-スポンジ、筋芽細胞 H9c2 細胞を表現するラインを発現する α-MHC-EGFP-miR-181-sponge コンストラクトと蛍光活性化セル ネオマイシンと培養される GFP 陽性 H9c2 細胞に (FACs) の並べ替え順(G418)。ネオマイシンの安定的な成長は、次モノクローナル細胞集団は追加 FACs と単一細胞のクローニングによって確立されます。結果筋 H9c2-ミール-181-スポンジ-GFP の細胞は、ミール-181 ターゲット蛋白質の発現増加を評価したミール 181 家族の機能の損失を展示し、スクランブル非機能的なスポンジを発現する H9c2 細胞と比較しています。さらに、正荷電リポソーム粒子と負荷電のミール-181-スポンジ プラスミドは錯形成によってミール-181-スポンジ構造の全身の配信のための nanovector を開発します。GFP のin vivoイメージングを 3 週間にわたって、nanovector の複数の尾静脈注射は心臓に固有の方法でミール 181 スポンジの重要な表現を促進することが明らかに。重要なは、腎臓や肝臓ではなく心臓の組織で、ミール 181 機能の損失が観察されます。MiRNA のスポンジは、組織固有の miRNA の発現を抑制する強力な方法です。組織固有のプロモーターからミルナ スポンジ式の運転 miRNA 阻害は、対象となる臓器や組織に限定することができますの特異性を提供します。さらに、nanovector や miRNA スポンジの技術を組み合わせることにより、効果的な配信と組織固有の miRNA 阻害体内。

Introduction

最後の 20 年間、人間の病気の miRNAs の重要な役割を指摘している数多くの研究がずっとあります。文献の大きいボディからの調査結果は、がん1および心血管疾患2,3,4,5などの疾患の病態において Mirna の紛れもない重要性を示しています。たとえば、ミール 21 は、増加細胞周期と細胞増殖6の結果、多くのがんで亢進です。C 型肝炎の感染症でミール 1227ウイルスの複製に重要な役割を果たしているし、ミール 122 の抑制が8ウイルス量を減少させることが示されています。心臓肥大のミール-212/132 は心で亢進、9病理学的表現型に関与します。誘導 miRNA の機能抑制または、ダウンレギュレーションの明白な重要性は、治療上ほとんどすべての病気の miRNA の生物学を悪用するための機会を示唆しています。

4 ミール 181 家族のメンバー、ミール-181a/b/c/d は、人間のゲノム ゲノム 3 つの場所にあります。非コーディングの RNA ホスト遺伝子 (MIR181A1 HG) のイントロン領域は、ミール-181-a/b – 1 クラスターをエンコードします。NR6A1 遺伝子のイントロン領域は、ミール-181-a/b-2 をエンコードします。ミール-181-c/d クラスターは染色体 19 の未同定トラン スクリプトにあります。ミール 181 家族のすべてのメンバーは同じ「シード」シーケンスを共有し、4 ミール 181 家族全員同じ mRNA ターゲットを調整できる可能性があります。

私たち3,4等10末期心不全中ミール 181 家族の重要性を強調しています。我々 はまた、ミール-181 c アップレギュレーションが II 型糖尿病など、心臓病のリスクの増加、肥満、加齢3,4、5と関連付けられる病理学の条件の下で発生することを認識しています。それは、過剰発現のミール-181 c が心臓機能障害4につながる酸化ストレスを引き起こすことが仮定されています。

いくつかのグループが、ミルナは、ミトコンドリア11,12,13,14, しかし、我々 はミール-181 c は処理、核ゲノムに由来を示すために最初に示唆しているとその後 RISC3内のミトコンドリアへの移行。さらに、ハート5のミトコンドリアのコンパートメントにミール 181a およびミール 181b 低発現が検出されました。重要なは、我々 を発見したミール-181 c mt COX1 mRNA の発現を抑制する実証 Mirna がミトコンドリア遺伝子に参加し、ミトコンドリアの機能3,4を変更することにより。

この資料では、心筋全体のミール 181 家族をノックダウンする miRNA スポンジを設計するために必要な方法論について説明します。さらに、我々 は、ミール-181-スポンジの生体内でのアプリケーションのためのプロトコルを概説します。

Protocol

すべての実験手順は、機関動物ケアおよび使用委員会のジョンズ ・ ホプキンス大学によって承認されました。 1. スポンジ デザイン マイクロ Rna の 3′ UTR のバインド注: A miRNA 機能そのターゲット Mrna の 3′ 非翻訳領域 (UTR) 部分的に補足のサイトと特定の基本ペアリング対話を通じて包括的なレビューを参照してくださいバーテル)15</su…

Representative Results

固定して transfected pEGFP-ミール-181-スポンジ-表現 H9c2 細胞 (4.2 の手順) から、全体のミール 181 家族 (ミール 181a、ミール 181b、ミール-181 c、およびミール-181 d) の式は pEGFP スクランブル表現 H9c2 細胞を基準にして緩やかな減少しました。ミール 181 家族の競争力阻害剤としてミール-181-スポンジがあり、我々 が予想する式のミール-181 c ミトコンドリア遺伝子をターゲッ?…

Discussion

この記事は設計および miRNA スポンジの合成を説明し、どのようにスポンジの組織特異的発現は組織特異 miRNA 家族式を抑制する強力なツール。

我々 は心臓におけるプロモーターと発現プラスミドにスポンジをターゲット ミール 181 家族で複製することができますを示しています。配信の nanovector 粒子にプラスミッドを効率的にパッケージできる両方体外と体内<…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

我々 は生化学と分子生物学のアンソニー K. L. レオンに感謝、ブルームバーグ公衆衛生大学院、ジョンズ ・ ホプキンス大学彼の技術のためにミール-181-スポンジ構造の設計に役立ちます。我々 はまた、ポリーナ Sysa シャーと専攻、比較病理学、miRNA スポンジ配信の生体内イメージングによる彼らのテクニカル サポートにジョンズ ・ ホプキンス医療機関のキャスリーン ・ Gabrielson に感謝します。

この仕事はだった (チャールズ Steenbergen) に HL39752、NIH からの補助金によって (Samarjit Das) に米国心臓協会 14SDG18890049 から科学者の開発助成金でサポートされています。ラット心臓固有のプロモーターは、シンシナティ小児病院のジェフリー D. Molkentin によって提供された寛大。

Materials

pEGFP-C1 vector Addgene 6084-1
In-fusion Clontech 121416
QIAprep Miniprep Qiagen 27104
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704
miR-181-sponge synthesis Introgen GeneArt custome made
PCR primers Integrated DNA Technologies custome
EcoRI enzymes New Endland Biolabs R0101S
KpnI enzymes New Endland Biolabs R0142S
Rapid DNA Ligation Kit Sigma-Aldrich 11635379001
H9c2 cells ATCC CRL-1446
DMEM Media Thermo Fisher Scientific 11965092
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 10082139
Nucleofector 2b Device Lonza AAB-1001
Nucleofector Kits for H9c2 (2-1) Lonza VCA-1005
G418, Geneticin Thermo Fisher Scientific 11811023
FACSAria II Flow cytometer BD Bioscience 644832
Branson 450 sonifier Marshall Scientific EDP 100-214-239
The Xenogen IVIS Spectrum optical imaging device Caliper Life Sciences
Anti-MTCO1 antibody Abcam ab14705
α-tubulin antibody Abcam ab7291
Sequoia C256 ultrasound system Siemens
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References

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In VivoNanovectorMicroRNA SpongeHeart-specificMicroRNA KnockdownEGFR PlasmidCMV PromoterAlpha-myosin Heavy Chain PromoterDNA PurificationBacterial TransformationLigation
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Kent, O. A., Steenbergen, C., Das, S. In Vivo Nanovector Delivery of a Heart-specific MicroRNA-sponge. J. Vis. Exp. (136), e57845, doi:10.3791/57845 (2018).
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