En Vivo Nanovector entrega de una esponja de microARN específicos de corazón
Summary
Inhibición de tejidos específicos microRNA es una tecnología que está poco desarrollada en el campo de microARN. Adjunto, describimos un protocolo para inhibir con éxito la familia de microRNA miR-181 en mioblastos células del corazón. Nanovector tecnología se utiliza para entregar un microRNA esponja que demuestra importantes en vivo cardio-específica miR-181 familia inhibición.
Abstract
MicroRNA (miRNA) es pequeño no codificante del RNA que inhibe la expresión postranscripcional ARN mensajero (ARNm). Enfermedades humanas, como el cáncer y las enfermedades cardiovasculares, se han demostrado para activar el tejido o célula-específica miRNA expresión asociada a progresión de la enfermedad. La inhibición de expresión de miRNA ofrece la posibilidad de una intervención terapéutica. Sin embargo, los enfoques tradicionales para inhibir miRNAs, empleando oligonucleótidos antagomir afectan funciones específicas miRNA suministro global. Adjunto, presentamos un protocolo para la inhibición de cardio-específica en vivo de la familia miR-181 en un modelo de rata. Una construcción de miRNA-esponja está diseñada para incluir secuencias repetidas enlace anti-miR-181 10. El promotor de la cardio-específico α-MHC se clona en la columna vertebral de pEGFP para impulsar la expresión de miR-181 miRNA-esponja de cardio-específico. Para crear una célula estable línea expresando el miR-181-esponja, mioblastos H9c2 células transfected con el constructo α-MHC-EGFP-miR-181-sponge y ordenado por celular activado por fluorescencia (FACs) de clasificación en GFP positivas H9c2 las células que se cultivan con neomicina (G418). Después de un crecimiento estable en neomicina, poblaciones de células monoclonales son establecidas por FACs adicional y la clonación de la célula. Las células resultantes de H9c2-miR-181-esponja-GFP mioblastos exhiben una pérdida de función de miembros de la familia miR-181 según lo determinado por el aumento de la expresión de las proteínas diana de miR-181 y compararon H9c2 las células con una esponja no funcional de scramble. Además, desarrollamos un nanovector para la entrega sistémica de la construcción de la miR-181-esponja secuestrantes nanopartículas liposomal con carga positiva y carga negativa miR-181-esponja plásmidos. En vivo la proyección de imagen de GFP revela que múltiples inyecciones de vena de la cola de un nanovector durante un período de tres semanas son capaces de promover una expresión significativa de la miR-181-esponja de forma cardio-específico. Lo importante, se observa una pérdida de función de miR-181 en el tejido del corazón pero no en el riñón o el hígado. La esponja de miRNA es un método eficaz para inhibir la expresión del miRNA de tejidos específicos. Conducir a la expresión del miRNA-esponja de un promotor específico de tejido proporciona especificidad de la inhibición de miRNA, que puede limitarse a una específica órgano o tejido. Además, combinando tecnologías nanovector y miRNA-esponja permite una entrega efectiva y la inhibición de miRNA de tejidos específicos en vivo.
Introduction
En las últimas dos décadas, ha habido numerosos estudios que han señalado el importante papel de miRNAs en enfermedad humana. Resultados de un gran cuerpo de literatura demuestran la indiscutible importancia de miRNAs en la patofisiología de enfermedades como el cáncer1 y las enfermedades cardiovasculares2,3,4,5. Por ejemplo, miR-21 es upregulated en muchos cánceres, lo que resulta en un mayor ciclo celular y la célula proliferación6. En las infecciones de hepatitis C, miR-122 desempeña un papel importante en la replicación de los virus7, y se ha demostrado que la inhibición de la miR-122 disminuye la carga viral8. En la hipertrofia cardiaca, miR-212/132 es upregulated en el corazón y está implicado en el fenotipo patológico9. La importancia obvia de la desregulación o la inhibición funcional de un miRNA alza sugiere oportunidades para explotar terapéuticamente la biología miRNA en casi todas las enfermedades.
Los cuatro miembros de la familia del miR-181, miR-181a/b/c/d, se encuentran en tres lugares genómicos en el genoma humano. La región intronic de una codificación no host gene del ARN (MIR181A1-HG) codifica el conjunto de miR-181-a/b-1. La región intronic del NR6A1 gen codifica el miR-181-a/b-2. El cluster de miR-181-c/d se encuentra en una transcripción desacostumbrada en el cromosoma 19. Todos los miR-181 miembros de la familia comparten la misma secuencia de “semilla” y los cuatro miembros de familia miR-181 potencialmente pueden regular los mismo objetivos de mRNA.
Somos3,4 y otros10 han destacado la importancia de miR-181 miembros de la familia durante la insuficiencia de la fase final. También hemos reconocido que un upregulation de miR – 181c ocurre bajo condiciones patológicas asociadas con un mayor riesgo de enfermedades del corazón, como el tipo de diabetes II, la obesidad y el envejecimiento3,4,5. Se ha postulado que la sobreexpresión de miR – 181c causa estrés oxidativo que conduce a una disfunción cardíaca4.
Varios grupos han sugerido que miRNA existe en mitocondrias11,12,13,14, pero fuimos los primeros en demostrar que miR – 181 c se deriva del genoma nuclear, procesado, y Posteriormente se translocan a la mitocondria en el RISC3. Además, hemos detectado una baja expresión de miR-181a y miR-181b en el compartimiento mitocondrial del corazón5. Lo importante, hemos encontrado que miR – 181c reprime la expresión de mRNA de COX1 mt, lo que demuestra que los miRNAs participan en la regulación del gene mitocondrial y altera la función mitocondrial3,4.
Este artículo aborda la metodología necesaria para diseñar una esponja miRNA derribar a toda la familia miR-181 en los cardiomiocitos. Por otra parte, describiremos un protocolo para el uso en vivo de la miR-181-esponja.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este artículo describe el diseño y síntesis de una esponja de miRNA y demostró cómo la expresión específica de tejido de la esponja es una poderosa herramienta para inhibir la expresión familia miRNA de tejidos específicos.
Hemos demostrado que una familia miR-181 a esponja puede ser clonada en un plásmido de expresión con un promotor específico cardiaco. El plásmido puede empacarse eficientemente en una partícula nanovector para la entrega en vitro y en vivo us…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Anthony K. L. Leung del Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Bloomberg School of Public Health, Universidad de Johns Hopkins para su técnico ayudar con el diseño de la construcción de la miR-181-esponja. También agradecemos a Polina Sysa-Shah y Kathleen Gabrielson de Departamento de Molecular y Biopatología comparada, Johns Hopkins Medical instituciones para su asistencia técnica de la proyección de imagen en vivo de la entrega de miRNA-esponja.
Este trabajo fue financiado por becas del NIH, HL39752 (a Charles Steenbergen) y por una beca de desarrollo científico de la 14SDG18890049 de la Asociación Americana del corazón (a Samarjit Das). El promotor de cardio-específica de la rata fue generosamente proporcionado por Jeffery D. Molkentin en Hospital infantil de Cincinnati.
Materials
| pEGFP-C1 vector | Addgene | 6084-1 | |
| In-fusion | Clontech | 121416 | |
| QIAprep Miniprep | Qiagen | 27104 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| miR-181-sponge synthesis | Introgen GeneArt | custome made | |
| PCR primers | Integrated DNA Technologies | custome | |
| EcoRI enzymes | New Endland Biolabs | R0101S | |
| KpnI enzymes | New Endland Biolabs | R0142S | |
| Rapid DNA Ligation Kit | Sigma-Aldrich | 11635379001 | |
| H9c2 cells | ATCC | CRL-1446 | |
| DMEM Media | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10082139 | |
| Nucleofector 2b Device | Lonza | AAB-1001 | |
| Nucleofector Kits for H9c2 (2-1) | Lonza | VCA-1005 | |
| G418, Geneticin | Thermo Fisher Scientific | 11811023 | |
| FACSAria II Flow cytometer | BD Bioscience | 644832 | |
| Branson 450 sonifier | Marshall Scientific | EDP 100-214-239 | |
| The Xenogen IVIS Spectrum optical imaging device | Caliper Life Sciences | ||
| Anti-MTCO1 antibody | Abcam | ab14705 | |
| α-tubulin antibody | Abcam | ab7291 | |
| Sequoia C256 ultrasound system | Siemens |
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