In Vivo Nanovector consegna di una cuore specifici MicroRNA-spugna
Summary
Inibizione di tessuto-specifici microRNA è una tecnologia che è sottosviluppata nel campo dei microRNA. Qui, descriviamo un protocollo per inibire la famiglia di microRNA miR-181 in cellule dei mioblasti dal cuore. Nanovector tecnologia viene usata per fornire un microRNA spugna che dimostra significativa in vivo cardio-miR-181 famiglia inibizione specifica.
Abstract
MicroRNA (miRNA) è piccolo non-codificanti RNA che inibisce l’espressione post-trascrizionale RNA messaggero (mRNA). Malattie umane, come cancro e malattie cardiovascolari, sono stati indicati per attivare il tessuto e/o espressione di miRNA cellula-specifico associato a progressione della malattia. L’inibizione dell’espressione dei miRNA offre il potenziale per un intervento terapeutico. Tuttavia, gli approcci tradizionali per inibire Mirna, impiegando oligonucleotidi ipotesi, influisce sulle funzioni di miRNA specifici al momento della consegna globale. Qui, presentiamo un protocollo per l’inibizione in vivo cardio-specifico della famiglia miR-181 in un modello del ratto. Un costrutto di miRNA-spugna è progettato per includere 10 sequenze di associazione anti-miR-181 ripetuta. Il promotore di cardio specifiche α-MHC è clonato nel backbone del pEGFP per guidare l’espressione di miR-181 cardio specifici miRNA-spugna. Per creare una cella stabile linea esprimendo il miR-181-spugna, dei mioblasti H9c2 cellule è trasfettata con il costrutto α-MHC-EGFP-miR-181-sponge e filtrata per fluorescenza-attivato delle cellule ordinano (FACs) in cellule H9c2 positive GFP che sono coltivate con neomicina (G418). A seguito di una crescita stabile a neomicina, popolazioni di cellule monoclonali vengono stabilite mediante ulteriori FACs e clonazione di singola cellula. Cellule risultanti dei mioblasti H9c2-miR-181-spugna-GFP presentano una perdita di funzione dei membri della famiglia miR-181 come valutato attraverso l’aumentata espressione di proteine bersaglio miR-181 e confrontato alle cellule H9c2 esprimendo una spugna non funzionali di scramble. Inoltre, sviluppiamo un nanovector per la consegna sistematica del costrutto miR-181-spugna complessandosi liposomiale nanoparticelle caricato positivamente e negativamente miR-181-spugna plasmidi. In vivo imaging di GFP rivela che coda vena le iniezioni multiple di un nanovector su un periodo di tre settimane sono in grado di promuovere un’espressione significativa della miR-181-spugna in modo specifico per cardio. Cosa importante, una perdita di funzione di miR-181 è osservata nel tessuto del cuore ma non nel rene o del fegato. La spugna di miRNA è un potente metodo per inibire l’espressione di miRNA specifici del tessuto. L’espressione di miRNA-spugna di guida da un promotore tessuto-specifica fornisce specificità per l’inibizione di miRNA, che possa essere limitata a una mirata organo o tessuto. Inoltre, combinando tecnologie nanovector e miRNA-spugna consente un’erogazione efficace e tessuto-specifici miRNA inibizione in vivo.
Introduction
Negli ultimi due decenni, ci sono stati numerosi studi che hanno messo in evidenza il ruolo significativo dei miRNA nella malattia umana. Risultati da un grande corpo di letteratura dimostrano l’importanza innegabile dei miRNA nella fisiopatologia di malattie quali cancro1 e malattia cardiovascolare2,3,4,5. Ad esempio, miR-21 è aumentata in molti cancri, conseguente a un’aumentata proliferazione ciclo cellulare e6. Nelle infezioni di epatite C, miR-122 svolge un ruolo importante nella replicazione del virus7, ed è stato dimostrato che l’inibizione di miR-122 diminuisce il carico virale8. Nell’ipertrofia cardiaca, miR-212/132 è upregulated nel cuore ed è coinvolto nel fenotipo patologico9. L’evidente importanza del downregulation o inibizione funzionale di un miRNA sovraregolati suggerisce opportunità per sfruttare terapeuticamente la biologia di miRNA in quasi tutte le malattie.
I quattro membri della famiglia miR-181, miR-181 a/b/c/d, si trovano in tre luoghi genomic nel genoma umano. La regione intronic di un gene di host RNA non codificanti (MIR181A1-HG) codifica il cluster miR-181-a/b-1. La regione intronic del gene NR6A1 codifica il miR-181-a/b-2. Il cluster miR-181-c/d si trova in una trascrizione atipico sul cromosoma 19. Tutti i membri della famiglia di miR-181 condividono la stessa sequenza di “seme” e tutti i quattro membri della famiglia miR-181 potenzialmente possono regolare i medesimi obiettivi di mRNA.
Abbiamo3,4 e altri10 hanno sottolineato l’importanza di miR-181 membri della famiglia durante l’infarto di stadio finale. Abbiamo anche riconosciuto che un upregulation di miR – 181 quater si verifica in presenza di condizioni patologiche associate con un rischio aumentato di malattia cardiaca, quale il diabete di tipo II, obesità e invecchiamento3,4,5. È stato postulato che la sovraespressione di miR – 181c causa lo sforzo ossidativo che conduce a una disfunzione cardiaca4.
Parecchi gruppi hanno suggerito che esiste di miRNA in mitocondri11,12,13,14, ma siamo stati i primi a dimostrare che miR – 181 c è derivato dal genoma nucleare, elaborato, e successivamente spostato ai mitocondri in RISC3. Inoltre, abbiamo rilevato una bassa espressione di miR-181a e miR-181b nel compartimento mitocondriale del cuore5. D’importanza, abbiamo trovato che miR – 181c reprime l’espressione di mRNA di mt-COX1, dimostrando in tal modo che i miRNA partecipano alla regolazione del gene mitocondriale e alterano la funzione mitocondriale3,4.
Questo articolo discute la metodologia necessaria per progettare una miRNA-spugna per abbattere l’intera famiglia di miR-181 in cardiomiociti. Inoltre, abbiamo delineare un protocollo per l’applicazione in vivo della miR-181-spugna.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo articolo descritta la progettazione e la sintesi di una miRNA-spugna e ha dimostrato come l’espressione tessuto-specifica della spugna è un potente strumento per inibire l’espressione famiglia tessuto-specifici miRNA.
Abbiamo dimostrato che una famiglia di miR-181 spugna di targeting può essere clonata in un plasmide di espressione con un promotore specifico. Il plasmide può essere confezionato in modo efficiente in una particella di nanovector per la consegna sia in vitro</em…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Anthony K. L. Leung del dipartimento di biochimica e biologia molecolare, Bloomberg School of Public Health, Johns Hopkins University per la sua tecnica aiutare con la progettazione del costrutto di miR-181-spugna. Ringraziamo anche Polina Sysa-Shah e Kathleen Gabrielson del dipartimento di molecolare e comparativa Pathobiology, Johns Hopkins Medical istituzioni per la loro assistenza tecnica per l’imaging in vivo della consegna miRNA-spugna.
Quest’opera è stata sostenuta da sovvenzioni dal NIH, HL39752 (di Charles Steenbergen) e da una sovvenzione scienziato sviluppo l’American Heart Association 14SDG18890049 (a Samarjit Das). Il promotore di cardio-specifico del ratto è stato generosamente fornito da Jeffery D. Molkentin all’ospedale pediatrico di Cincinnati.
Materials
| pEGFP-C1 vector | Addgene | 6084-1 | |
| In-fusion | Clontech | 121416 | |
| QIAprep Miniprep | Qiagen | 27104 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| miR-181-sponge synthesis | Introgen GeneArt | custome made | |
| PCR primers | Integrated DNA Technologies | custome | |
| EcoRI enzymes | New Endland Biolabs | R0101S | |
| KpnI enzymes | New Endland Biolabs | R0142S | |
| Rapid DNA Ligation Kit | Sigma-Aldrich | 11635379001 | |
| H9c2 cells | ATCC | CRL-1446 | |
| DMEM Media | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10082139 | |
| Nucleofector 2b Device | Lonza | AAB-1001 | |
| Nucleofector Kits for H9c2 (2-1) | Lonza | VCA-1005 | |
| G418, Geneticin | Thermo Fisher Scientific | 11811023 | |
| FACSAria II Flow cytometer | BD Bioscience | 644832 | |
| Branson 450 sonifier | Marshall Scientific | EDP 100-214-239 | |
| The Xenogen IVIS Spectrum optical imaging device | Caliper Life Sciences | ||
| Anti-MTCO1 antibody | Abcam | ab14705 | |
| α-tubulin antibody | Abcam | ab7291 | |
| Sequoia C256 ultrasound system | Siemens |
References
- Hammond, S. M. microRNA detection comes of age. Nat Methods. 3 (1), 12-13 (2006).
- van Rooij, E., Olson, E. N. MicroRNAs: powerful new regulators of heart disease and provocative therapeutic targets. The Journal of Clinical Investigation. 117 (9), 2369-2376 (2007).
- Das, S., et al. Nuclear miRNA regulates the mitochondrial genome in the heart. Circulation Research. 110 (12), 1596-1603 (2012).
- Das, S., et al. miR-181c regulates the mitochondrial genome, bioenergetics, and propensity for heart failure in vivo. PLoS One. 9 (5), e96820 (2014).
- Das, S., et al. Divergent effects of miR-181 family members on myocardial function through protective cytosolic and detrimental mitochondrial microRNA targets. Journal of the American Heart Association. 6 (3), e004694 (2017).
- Sicard, F., Gayral, M., Lulka, H., Buscail, L., Cordelier, P. Targeting miR-21 for the therapy of pancreatic cancer. Molecular Therapy. 21 (5), 986-994 (2013).
- Jopling, C. L., Yi, M., Lancaster, A. M., Lemon, S. M., Sarnow, P. Modulation of hepatitis C virus RNA abundance by a liver-specific microRNA. Science. 309 (5740), 1577-1581 (2005).
- Lanford, R. E., et al. Therapeutic silencing of microRNA-122 in primates with chronic hepatitis C virus infection. Science. 327 (5962), 198-201 (2010).
- Ucar, A., et al. The miRNA-212/132 family regulates both cardiac hypertrophy and cardiomyocyte autophagy. Nature Communications. 3, 1078 (2012).
- Zhu, X., et al. Identification of micro-RNA networks in end-stage heart failure because of dilated cardiomyopathy. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (9), 1173-1187 (2013).
- Bandiera, S., et al. Nuclear outsourcing of RNA interference components to human mitochondria. PLoS One. 6 (6), e20746 (2011).
- Barrey, E., et al. Pre-microRNA and mature microRNA in human mitochondria. PLoS One. 6 (5), e20220 (2011).
- Bian, Z., et al. Identification of mouse liver mitochondria-associated miRNAs and their potential biological functions. Cell Research. 20 (9), 1076-1078 (2010).
- Kren, B. T., et al. MicroRNAs identified in highly purified liver-derived mitochondria may play a role in apoptosis. RNA Biology. 6 (1), 65-72 (2009).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
- Molkentin, J. D., Jobe, S. M., Markham, B. E. Alpha-myosin heavy chain gene regulation: delineation and characterization of the cardiac muscle-specific enhancer and muscle-specific promoter. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 28 (6), 1211-1225 (1996).
- Poliseno, L., et al. A coding-independent function of gene and pseudogene mRNAs regulates tumour biology. Nature. 465 (7301), 1033-1038 (2010).
- Henao-Mejia, J., et al. The microRNA miR-181 is a critical cellular metabolic rheostat essential for NKT cell ontogenesis and lymphocyte development and homeostasis. Immunity. 38 (5), 984-997 (2013).
- Williams, A., Henao-Mejia, J., Harman, C. C., Flavell, R. A. miR-181 and metabolic regulation in the immune system. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 78, 223-230 (2013).
- Hori, D., et al. miR-181b regulates vascular stiffness age dependently in part by regulating TGF-beta signaling. PLoS One. 12 (3), e0174108 (2017).
- Ebert, M. S., Sharp, P. A. MicroRNA sponges: progress and possibilities. RNA. 16 (11), 2043-2050 (2010).
- Ma, L., et al. Therapeutic silencing of miR-10b inhibits metastasis in a mouse mammary tumor model. Nature Biotechnology. 28 (4), 341-347 (2010).
- Davis, S., Lollo, B., Freier, S., Esau, C. Improved targeting of miRNA with antisense oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 34 (8), 2294-2304 (2006).
- Davis, S., et al. Potent inhibition of microRNA in vivo without degradation. Nucleic Acids Research. 37 (1), 70-77 (2009).
- Elmen, J., et al. LNA-mediated microRNA silencing in non-human primates. Nature. 452 (7189), 896-899 (2008).
- Esau, C. C. Inhibition of microRNA with antisense oligonucleotides. Methods. 44 (1), 55-60 (2008).
- Stenvang, J., Kauppinen, S. MicroRNAs as targets for antisense-based therapeutics. Expert Opinion on Biological Therapy. 8 (1), 59-81 (2008).
- Lennox, K. A., Behlke, M. A. A direct comparison of anti-microRNA oligonucleotide potency. Pharmaceutical Research. 27 (9), 1788-1799 (2010).
- Lennox, K. A., Behlke, M. A. Chemical modification and design of anti-miRNA oligonucleotides. Gene Therapy. 18 (12), 1111-1120 (2011).
- van Rooij, E., Olson, E. N. MicroRNA therapeutics for cardiovascular disease: opportunities and obstacles. Nature Reviews. Drug Discovery. 11 (11), 860-872 (2012).
- Stenvang, J., Petri, A., Lindow, M., Obad, S., Kauppinen, S. Inhibition of microRNA function by antimiR oligonucleotides. Silence. 3 (1), 1 (2012).
- Levin, A. A. A review of the issues in the pharmacokinetics and toxicology of phosphorothioate antisense oligonucleotides. Biochimica et Biophysica Acta. 1489 (1), 69-84 (1999).
- Flynt, A. S., Li, N., Thatcher, E. J., Solnica-Krezel, L., Patton, J. G. Zebrafish miR-214 modulates Hedgehog signaling to specify muscle cell fate. Nature Genetics. 39 (2), 259-263 (2007).
- Kloosterman, W. P., Lagendijk, A. K., Ketting, R. F., Moulton, J. D., Plasterk, R. H. Targeted inhibition of miRNA maturation with morpholinos reveals a role for miR-375 in pancreatic islet development. PLoS Biology. 5 (8), e203 (2007).
- Martello, G., et al. MicroRNA control of Nodal signalling. Nature. 449 (7159), 183-188 (2007).
- Fabani, M. M., Gait, M. J. miR-122 targeting with LNA/2′-O-methyl oligonucleotide mixmers, peptide nucleic acids (PNA), and PNA-peptide conjugates. RNA. 14 (2), 336-346 (2008).
- Fabani, M. M., et al. Efficient inhibition of miR-155 function in vivo by peptide nucleic acids. Nucleic Acids Research. 38 (13), 4466-4475 (2010).
- Babar, I. A., et al. Nanoparticle-based therapy in an in vivo microRNA-155 (miR-155)-dependent mouse model of lymphoma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), E1695-E1704 (2012).
- Torres, A. G., et al. Chemical structure requirements and cellular targeting of microRNA-122 by peptide nucleic acids anti-miRs. Nucleic Acids Research. 40 (5), 2152-2167 (2012).
- Kent, O. A., McCall, M. N., Cornish, T. C., Halushka, M. K. Lessons from miR-143/145: the importance of cell-type localization of miRNAs. Nucleic Acids Research. 42 (12), 7528-7538 (2014).
