Na Vivo Entrega de nanovector de uma coração-específicas do MicroRNA-esponja
Summary
Inibição de microRNA tecido-específica é uma tecnologia que é subdesenvolvida no campo do microRNA. Aqui, descrevemos um protocolo para inibir com sucesso a família miR-181 microRNA nas células myoblast do coração. Nanovector tecnologia é usada para entregar um microRNA esponja que demonstra significativa na vivo cardio-específicos miR-181 família inibição.
Abstract
MicroRNA (miRNA) é pequeno não-codificantes do RNA que inibe a expressão pós-transcricional RNA mensageiro (mRNA). Doenças humanas, tais como câncer e doenças cardiovasculares, foram mostradas para ativar o tecido e/ou expressão de miRNA célula específicos associados com a progressão da doença. A inibição da expressão de miRNA oferece a possibilidade de uma intervenção terapêutica. No entanto, as abordagens tradicionais para inibir os miRNAs, empregando antagomir oligonucleotides, afetam funções específicas de miRNA na entrega global. Neste documento, apresentamos um protocolo para a inibição de cardio-específicas na vivo da família miR-181 em um modelo do rato. Uma construção de miRNA-esponja é projetada para incluir 10 sequências repetidas de miR-181 de vinculação. O promotor específico cardio α-MHC é clonado para a determinação de pEGFP para dirigir a expressão específica cardio miR-181 miRNA-esponja. Para criar uma célula estável linha expressando a miR-181-esponja, myoblast H9c2 células é transfected com construção de α-MHC-EGFP-miR-181-sponge e classificada por fluorescência-ativado da pilha (FACs) de classificação em células GFP positivas H9c2 que são cultivadas com neomicina (G418). Após um crescimento estável em neomicina, populações de células monoclonais são estabelecidas pela FACs adicionais e clonagem de célula única. As células de H9c2-miR-181-esponja-GFP resultantes myoblast exibem uma perda da função dos membros da família miR-181, avaliadas através do aumento da expressão de proteínas do alvo miR-181 e em comparação com células H9c2, expressando uma esponja não-funcional scramble. Além disso, nós desenvolvemos um nanovector para a entrega sistêmica da construção de miR-181-esponja por complexantes carregados positivamente lipossomas nanopartículas e miR-181-esponja plasmídeos com carga negativa. Na vivo por imagens do GFP revela que múltiplas injeções de veia cauda de um nanovector durante um período de três semanas são capazes de promover uma expressão significativa da miR-181-esponja de forma cardio-específica. Importante, uma perda da função de miR-181 é observada no tecido do coração, mas não no rim ou fígado. A miRNA-esponja é um método poderoso para inibir a expressão tecido-específica miRNA. A expressão de miRNA-esponja de condução de um promotor de tecido-específica fornece especificidade para a inibição de miRNA, que pode ser confinada a um alvo de órgão ou tecido. Além disso, combinando tecnologias nanovector e miRNA-esponja permite uma entrega eficaz e miRNA tecido-específica inibição na vivo.
Introduction
Nas últimas duas décadas, tem havido inúmeros estudos que apontam para o papel significativo dos miRNAs em doenças humanas. Resultados de um vasto corpo de literatura demonstram a importância inegável de miRNAs na fisiopatologia de doenças como o câncer1 e doença cardiovascular2,3,4,5. Por exemplo, miR-21 é upregulated em muitos tipos de câncer, resultando em um aumento ciclo celular e celular proliferação6. Em infecções de hepatite C, miR-122 desempenha um papel importante na replicação do vírus7, e tem sido demonstrado que a inibição da miR-122 diminui a carga viral8. Na hipertrofia cardíaca, miR-212/132 é upregulated no coração e está envolvido com o fenótipo patológica9. A importância óbvia da downregulation ou inibição funcional de uma miRNA upregulated sugere oportunidades para explorar terapeuticamente a biologia de miRNA em quase todas as doenças.
Os quatro membros da família 181-miR, miR-181/b/c/d, encontram-se em três locais genoma no genoma humano. A região intrônicas de um gene de anfitrião de RNA não-codificante (MIR181A1-HG) codifica o cluster de miR-181-a/b-1. A região intrônicas do gene NR6A1 codifica a miR-181-a/b-2. O cluster miR-181-c/d está localizado em uma transcrição descaracterizada no cromossomo 19. Todos os membros da família miR-181 compartilham a mesma sequência de “semente” e todos os quatro membros da família miR-181 potencialmente podem regular os mesmos objectivos de mRNA.
Nós3,4 e outros10 já destacou a importância da miR-181 membros da família durante a insuficiência cardíaca estágio final. Também reconhecemos que uma upregulation de miR – 181c ocorre sob condições patológicas associadas com um risco aumentado de doença cardíaca, tais como diabetes tipo II, obesidade e envelhecimento3,4,5. Foi postulado que a superexpressão de miR – 181c provoca estresse oxidativo, que leva a uma disfunção cardíaca4.
Vários grupos têm sugerido que miRNA existem mitocôndrias11,12,13,14, mas nós fomos os primeiros a demonstrar que miR – 181 c é derivado do genoma nuclear, processado, e posteriormente translocada para a mitocôndria no RISC3. Além disso, detectamos uma baixa expressão de miR-181 e miR-181b no compartimento mitocondrial do coração5. Importante, nós encontramos que miR – 181c reprime a expressão de RNAm de mt-COX1, mostrando assim que os miRNAs participar no Regulamento do gene mitocondrial e alterar a função mitocondrial3,4.
Este artigo discute a metodologia necessária para projetar uma miRNA-esponja para derrubar toda a família em cardiomyocytes miR-181. Além disso, nós esboçamos um protocolo para o aplicativo na vivo da miR-181-esponja.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este artigo descreveu o projeto e a síntese de uma esponja-miRNA e demonstrou como a expressão tecido-específica da esponja é uma poderosa ferramenta para inibir a expressão família miRNA tecido-específica.
Temos demonstrado que uma família de miR-181 visando a esponja pode ser clonada em um plasmídeo de expressão com um promotor específico cardíaco. O plasmídeo pode ser eficientemente empacotado em uma partícula de nanovector para entrega tanto in vitro e em vivo</e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Anthony K. L. Leung do departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Bloomberg School of Public Health, Universidade de Johns Hopkins para seu técnico ajuda com projeto de construção de miR-181-esponja. Agradecemos também Polina Sysa-Sousa e Kathleen Gabrielson do departamento de Molecular e Patobiológico comparativo, Johns Hopkins Medical instituições para sua assistência técnica pela imagem no vivo da entrega miRNA-esponja.
Este trabalho foi apoiado por concessões do NIH, HL39752 (para Charles Steenbergen) e por uma concessão de desenvolvimento de cientista do 14SDG18890049 a associação americana do coração (para Samarjit Das). O promotor de cardio-específico do rato foi generosamente fornecido por Jeffery D. Molkentin no Hospital infantil de Cincinnati.
Materials
| pEGFP-C1 vector | Addgene | 6084-1 | |
| In-fusion | Clontech | 121416 | |
| QIAprep Miniprep | Qiagen | 27104 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| miR-181-sponge synthesis | Introgen GeneArt | custome made | |
| PCR primers | Integrated DNA Technologies | custome | |
| EcoRI enzymes | New Endland Biolabs | R0101S | |
| KpnI enzymes | New Endland Biolabs | R0142S | |
| Rapid DNA Ligation Kit | Sigma-Aldrich | 11635379001 | |
| H9c2 cells | ATCC | CRL-1446 | |
| DMEM Media | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10082139 | |
| Nucleofector 2b Device | Lonza | AAB-1001 | |
| Nucleofector Kits for H9c2 (2-1) | Lonza | VCA-1005 | |
| G418, Geneticin | Thermo Fisher Scientific | 11811023 | |
| FACSAria II Flow cytometer | BD Bioscience | 644832 | |
| Branson 450 sonifier | Marshall Scientific | EDP 100-214-239 | |
| The Xenogen IVIS Spectrum optical imaging device | Caliper Life Sciences | ||
| Anti-MTCO1 antibody | Abcam | ab14705 | |
| α-tubulin antibody | Abcam | ab7291 | |
| Sequoia C256 ultrasound system | Siemens |
References
- Hammond, S. M. microRNA detection comes of age. Nat Methods. 3 (1), 12-13 (2006).
- van Rooij, E., Olson, E. N. MicroRNAs: powerful new regulators of heart disease and provocative therapeutic targets. The Journal of Clinical Investigation. 117 (9), 2369-2376 (2007).
- Das, S., et al. Nuclear miRNA regulates the mitochondrial genome in the heart. Circulation Research. 110 (12), 1596-1603 (2012).
- Das, S., et al. miR-181c regulates the mitochondrial genome, bioenergetics, and propensity for heart failure in vivo. PLoS One. 9 (5), e96820 (2014).
- Das, S., et al. Divergent effects of miR-181 family members on myocardial function through protective cytosolic and detrimental mitochondrial microRNA targets. Journal of the American Heart Association. 6 (3), e004694 (2017).
- Sicard, F., Gayral, M., Lulka, H., Buscail, L., Cordelier, P. Targeting miR-21 for the therapy of pancreatic cancer. Molecular Therapy. 21 (5), 986-994 (2013).
- Jopling, C. L., Yi, M., Lancaster, A. M., Lemon, S. M., Sarnow, P. Modulation of hepatitis C virus RNA abundance by a liver-specific microRNA. Science. 309 (5740), 1577-1581 (2005).
- Lanford, R. E., et al. Therapeutic silencing of microRNA-122 in primates with chronic hepatitis C virus infection. Science. 327 (5962), 198-201 (2010).
- Ucar, A., et al. The miRNA-212/132 family regulates both cardiac hypertrophy and cardiomyocyte autophagy. Nature Communications. 3, 1078 (2012).
- Zhu, X., et al. Identification of micro-RNA networks in end-stage heart failure because of dilated cardiomyopathy. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (9), 1173-1187 (2013).
- Bandiera, S., et al. Nuclear outsourcing of RNA interference components to human mitochondria. PLoS One. 6 (6), e20746 (2011).
- Barrey, E., et al. Pre-microRNA and mature microRNA in human mitochondria. PLoS One. 6 (5), e20220 (2011).
- Bian, Z., et al. Identification of mouse liver mitochondria-associated miRNAs and their potential biological functions. Cell Research. 20 (9), 1076-1078 (2010).
- Kren, B. T., et al. MicroRNAs identified in highly purified liver-derived mitochondria may play a role in apoptosis. RNA Biology. 6 (1), 65-72 (2009).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
- Molkentin, J. D., Jobe, S. M., Markham, B. E. Alpha-myosin heavy chain gene regulation: delineation and characterization of the cardiac muscle-specific enhancer and muscle-specific promoter. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 28 (6), 1211-1225 (1996).
- Poliseno, L., et al. A coding-independent function of gene and pseudogene mRNAs regulates tumour biology. Nature. 465 (7301), 1033-1038 (2010).
- Henao-Mejia, J., et al. The microRNA miR-181 is a critical cellular metabolic rheostat essential for NKT cell ontogenesis and lymphocyte development and homeostasis. Immunity. 38 (5), 984-997 (2013).
- Williams, A., Henao-Mejia, J., Harman, C. C., Flavell, R. A. miR-181 and metabolic regulation in the immune system. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 78, 223-230 (2013).
- Hori, D., et al. miR-181b regulates vascular stiffness age dependently in part by regulating TGF-beta signaling. PLoS One. 12 (3), e0174108 (2017).
- Ebert, M. S., Sharp, P. A. MicroRNA sponges: progress and possibilities. RNA. 16 (11), 2043-2050 (2010).
- Ma, L., et al. Therapeutic silencing of miR-10b inhibits metastasis in a mouse mammary tumor model. Nature Biotechnology. 28 (4), 341-347 (2010).
- Davis, S., Lollo, B., Freier, S., Esau, C. Improved targeting of miRNA with antisense oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 34 (8), 2294-2304 (2006).
- Davis, S., et al. Potent inhibition of microRNA in vivo without degradation. Nucleic Acids Research. 37 (1), 70-77 (2009).
- Elmen, J., et al. LNA-mediated microRNA silencing in non-human primates. Nature. 452 (7189), 896-899 (2008).
- Esau, C. C. Inhibition of microRNA with antisense oligonucleotides. Methods. 44 (1), 55-60 (2008).
- Stenvang, J., Kauppinen, S. MicroRNAs as targets for antisense-based therapeutics. Expert Opinion on Biological Therapy. 8 (1), 59-81 (2008).
- Lennox, K. A., Behlke, M. A. A direct comparison of anti-microRNA oligonucleotide potency. Pharmaceutical Research. 27 (9), 1788-1799 (2010).
- Lennox, K. A., Behlke, M. A. Chemical modification and design of anti-miRNA oligonucleotides. Gene Therapy. 18 (12), 1111-1120 (2011).
- van Rooij, E., Olson, E. N. MicroRNA therapeutics for cardiovascular disease: opportunities and obstacles. Nature Reviews. Drug Discovery. 11 (11), 860-872 (2012).
- Stenvang, J., Petri, A., Lindow, M., Obad, S., Kauppinen, S. Inhibition of microRNA function by antimiR oligonucleotides. Silence. 3 (1), 1 (2012).
- Levin, A. A. A review of the issues in the pharmacokinetics and toxicology of phosphorothioate antisense oligonucleotides. Biochimica et Biophysica Acta. 1489 (1), 69-84 (1999).
- Flynt, A. S., Li, N., Thatcher, E. J., Solnica-Krezel, L., Patton, J. G. Zebrafish miR-214 modulates Hedgehog signaling to specify muscle cell fate. Nature Genetics. 39 (2), 259-263 (2007).
- Kloosterman, W. P., Lagendijk, A. K., Ketting, R. F., Moulton, J. D., Plasterk, R. H. Targeted inhibition of miRNA maturation with morpholinos reveals a role for miR-375 in pancreatic islet development. PLoS Biology. 5 (8), e203 (2007).
- Martello, G., et al. MicroRNA control of Nodal signalling. Nature. 449 (7159), 183-188 (2007).
- Fabani, M. M., Gait, M. J. miR-122 targeting with LNA/2′-O-methyl oligonucleotide mixmers, peptide nucleic acids (PNA), and PNA-peptide conjugates. RNA. 14 (2), 336-346 (2008).
- Fabani, M. M., et al. Efficient inhibition of miR-155 function in vivo by peptide nucleic acids. Nucleic Acids Research. 38 (13), 4466-4475 (2010).
- Babar, I. A., et al. Nanoparticle-based therapy in an in vivo microRNA-155 (miR-155)-dependent mouse model of lymphoma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), E1695-E1704 (2012).
- Torres, A. G., et al. Chemical structure requirements and cellular targeting of microRNA-122 by peptide nucleic acids anti-miRs. Nucleic Acids Research. 40 (5), 2152-2167 (2012).
- Kent, O. A., McCall, M. N., Cornish, T. C., Halushka, M. K. Lessons from miR-143/145: the importance of cell-type localization of miRNAs. Nucleic Acids Research. 42 (12), 7528-7538 (2014).
