In Vivo Nanovector Lieferung von einem Herz-spezifische MicroRNA-Schwamm
Summary
Gewebe-spezifische MicroRNA-Hemmung ist eine Technologie, die im Feld MicroRNA unterentwickelt ist. Hier beschreiben wir ein Protokoll, um erfolgreich die MiR-181 MicroRNA-Familie in Myoblast Zellen aus dem Herzen zu hemmen. Nanovector-Technologie wird verwendet, um eine MicroRNA Schwamm zu liefern, die erhebliche in Vivo Cardio-spezifische MiR-181 Familie Hemmung zeigt.
Abstract
MicroRNA (MiRNA) ist kleine nicht-kodierende RNA die posttranskriptionelle Boten-RNA (mRNA) Ausdruck hemmt. Menschlichen Krankheiten wie Krebs und Herz-Kreislauf-Krankheit haben gezeigt, um Gewebe und/oder zellspezifische MiRNA Ausdruck verbunden mit Fortschreiten der Krankheit zu aktivieren. Die Hemmung der MiRNA Ausdruck bietet das Potenzial für eine therapeutische Intervention. Jedoch beeinflussen traditionelle Ansätze zur MiRNAs, beschäftigt Antagomir Oligonukleotide, hemmen bestimmte MiRNA-Funktionen bei der weltweiten Lieferung. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die in Vivo Cardio-spezifischen Hemmung der MiR-181-Familie in einem Rattenmodell. Ein MiRNA-Schwamm-Konstrukt soll 10 wiederholten miR-181-Bindung-Sequenzen enthalten. Der Cardio-spezifische α-MHC-Promoter wird in das pEGFP Rückgrat den Cardio-spezifische MiR-181 MiRNA-Schwamm Ausdruck fahren geklont. Um eine stabile Zelle erstellen Linie mit dem Ausdruck der MiR-181-Schwamm “,” Myoblast H9c2 Zellen mit α-MHC-EGFP-miR-181-sponge Konstrukt transfiziert und Fluoreszenz-aktivierte Zelle Sortieren (FACs) in GLP positive H9c2-Zellen, die mit Neomycin kultiviert werden sortiert (G418). Nach einem stabilen Wachstum im Neomycin sind monoklonale Zellpopulationen durch zusätzliche FACs und einzelne Zelle Klonen gegründet. Die resultierenden Myoblast H9c2-MiR-181-Schwamm-GFP Zellen zeigen einen Verlust der Funktion von MiR-181 Familienmitglieder durch die erhöhte Expression von MiR-181 Zielproteine bewertet und im Vergleich zu H9c2-Zellen, die mit dem Ausdruck eines Gerangel nichtfunktionale Schwamm. Darüber hinaus entwickeln wir ein Nanovector für die systemische Lieferung des MiR-181-Schwamm-Konstrukts durch Komplexbildner positiv geladenen liposomalen Nanopartikel und negativ geladene MiR-181-Schwamm Plasmide. In-Vivo Bildgebung der GLP zeigt, dass mehrere Schweif Vene Injektionen von einer Nanovector über einen Zeitraum von drei Wochen in der Lage, einen signifikanten Ausdruck von MiR-181-Schwamm ein Cardio-spezifisch zu fördern. Wichtig ist, ist ein Verlust von MiR-181-Funktion im Herzgewebe, aber nicht in der Niere oder der Leber beobachtet. Die MiRNA-Schwamm ist eine leistungsfähige Methode, gewebespezifische MiRNA Ausdruck zu hemmen. Fahren des MiRNA-Schwamm-Ausdrucks von einem gewebespezifischen Promoter bietet Spezifität für die MiRNA-Hemmung, die auf eine gezielte Organ oder Gewebe beschränkt werden kann. Darüber hinaus erlaubt die Kombination von Nanovector und MiRNA-Schwamm-Technologien eine effektive Lieferung und gewebespezifische MiRNA Hemmung in Vivo.
Introduction
In den letzten zwei Jahrzehnten wurden zahlreiche Studien, die die wichtige Rolle der MiRNAs bei der menschlichen Krankheit hingewiesen haben. Ergebnisse von einem großen Körper der Literatur zeigen die unbestreitbare Bedeutung von MiRNAs in der Pathophysiologie von Erkrankungen wie Krebs1 und Herz-Kreislauf-Krankheit2,3,4,5. Zum Beispiel ist MiR-21 hochreguliert in vielen Krebsarten, was zu einer erhöhten Zellzyklus und Zelle Verbreitung-6. Hepatitis C-Infektionen MiR-122 spielt eine wichtige Rolle bei der Replikation des Virus7, und es hat sich gezeigt, dass die Hemmung der MiR-122 die Viruslast8verringert. In Herzhypertrophie MiR-212/132 ist hochreguliert im Herzen und engagiert sich in der pathologischen Phänotyp-9. Die offensichtliche Bedeutung der Downregulation oder funktionelle Hemmung der eine hochreguliert MiRNA schlägt Möglichkeiten die MiRNA-Biologie bei fast allen Erkrankungen therapeutisch zu nutzen.
Die vier Familienmitglieder MiR-181, MiR-181a/b/c/d, sind in drei genomischen Standorten im menschlichen Genom gefunden. Die intronischen Region eines nicht-kodierende RNA Host Gens (MIR181A1-HG) kodiert die Cluster von MiR-181-a/b-1. Die intronischen Region des NR6A1-Gens kodiert die MiR-181-a/b-2. MiR-181-c/d-Cluster befindet sich in einem fußgelenkes Protokoll auf Chromosom 19. Die MiR-181 Familienmitglieder teilen die gleiche Sequenz “Samen” und alle vier MiR-181 Familienmitglieder können potentiell die gleichen mRNA Ziele regulieren.
Wir3,4 und andere10 haben deutlich gemacht, dass die Bedeutung von MiR-181 Familienmitglieder bei terminaler Herzinsuffizienz. Wir haben auch erkannt, dass ein MiR – 181c Hochregulation unter pathologischen Bedingungen ein erhöhtes Risiko für Herz-Kreislauferkrankungen, wie Typ-II-Diabetes, Übergewicht und Alterung3,4,5zugeordnet tritt. Es wurde postuliert worden, dass die Überexpression von MiR – 181c verursacht oxidativen Stress führt zu einer kardialen Dysfunktion4.
Mehrere Gruppen haben vorgeschlagen, dass MiRNA in Mitochondrien11,12,13,14vorhanden, aber wir die ersten waren, die zeigen, dass MiR – 181 c ergibt sich aus dem Kerngenom verarbeitet, und anschließend umgesiedelt zu den Mitochondrien in den RISC-3. Darüber hinaus haben wir eine geringe Expression von MiR-181a und MiR 181b im mitochondrialen Abteil des Herzens5festgestellt. Wichtig ist, haben wir gefunden, dass MiR – 181 c unterdrückt die Mt-COX1 mRNA Expression, dadurch belegen, dass MiRNAs in der mitochondrialen Genregulation teilnehmen und mitochondriale Funktion3,4zu ändern.
Dieser Artikel beschreibt die Methodik MiRNA-Schwamm die ganze MiR-181-Familie in Kardiomyozyten abzureißen entwerfen. Darüber hinaus erläutern wir ein Protokoll für die in-Vivo -Anwendung von MiR-181-Schwamm.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Artikel beschrieben, das Design und die Synthese eines MiRNA-Schwamm und demonstriert, wie der gewebespezifischen Ausdruck des Schwammes ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur gewebespezifischen MiRNA Familie Ausdruck hemmen.
Wir haben gezeigt, dass eine MiR-181-Familie targeting Schwamm in einer expressionsplasmid mit einem Herz-Kreislauf-spezifischen Promotor geklont werden kann. Das Plasmid kann effizient in ein Nanovector Teilchen für die Lieferung verpackt werden in Vitro</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir bedanken uns bei Anthony K. L. Leung von der Fakultät für Biochemie und Molekularbiologie, Bloomberg School of Public Health, Johns Hopkins University für seine technische Hilfe bei der Gestaltung der MiR-181-Schwamm-Konstrukt. Wir danken auch Polina Sysa-Shah und Kathleen Gabrielson der Abteilung Molekulare und vergleichende Pathobiologie, Johns Hopkins Medical Institutionen für ihre technische Unterstützung durch die in-Vivo Bildgebung der MiRNA-Schwamm-Lieferung.
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem NIH, HL39752 (zu Charles Steenbergen) und durch einen Wissenschaftler-Entwicklung-Zuschuss von der American Heart Association 14SDG18890049 (an Samarjit Das) unterstützt. Der Ratte Cardio-spezifischen Promoter wurde großzügig von Jeffery D. Molkentin am Cincinnati Children Hospital bereitgestellt.
Materials
| pEGFP-C1 vector | Addgene | 6084-1 | |
| In-fusion | Clontech | 121416 | |
| QIAprep Miniprep | Qiagen | 27104 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| miR-181-sponge synthesis | Introgen GeneArt | custome made | |
| PCR primers | Integrated DNA Technologies | custome | |
| EcoRI enzymes | New Endland Biolabs | R0101S | |
| KpnI enzymes | New Endland Biolabs | R0142S | |
| Rapid DNA Ligation Kit | Sigma-Aldrich | 11635379001 | |
| H9c2 cells | ATCC | CRL-1446 | |
| DMEM Media | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10082139 | |
| Nucleofector 2b Device | Lonza | AAB-1001 | |
| Nucleofector Kits for H9c2 (2-1) | Lonza | VCA-1005 | |
| G418, Geneticin | Thermo Fisher Scientific | 11811023 | |
| FACSAria II Flow cytometer | BD Bioscience | 644832 | |
| Branson 450 sonifier | Marshall Scientific | EDP 100-214-239 | |
| The Xenogen IVIS Spectrum optical imaging device | Caliper Life Sciences | ||
| Anti-MTCO1 antibody | Abcam | ab14705 | |
| α-tubulin antibody | Abcam | ab7291 | |
| Sequoia C256 ultrasound system | Siemens |
References
- Hammond, S. M. microRNA detection comes of age. Nat Methods. 3 (1), 12-13 (2006).
- van Rooij, E., Olson, E. N. MicroRNAs: powerful new regulators of heart disease and provocative therapeutic targets. The Journal of Clinical Investigation. 117 (9), 2369-2376 (2007).
- Das, S., et al. Nuclear miRNA regulates the mitochondrial genome in the heart. Circulation Research. 110 (12), 1596-1603 (2012).
- Das, S., et al. miR-181c regulates the mitochondrial genome, bioenergetics, and propensity for heart failure in vivo. PLoS One. 9 (5), e96820 (2014).
- Das, S., et al. Divergent effects of miR-181 family members on myocardial function through protective cytosolic and detrimental mitochondrial microRNA targets. Journal of the American Heart Association. 6 (3), e004694 (2017).
- Sicard, F., Gayral, M., Lulka, H., Buscail, L., Cordelier, P. Targeting miR-21 for the therapy of pancreatic cancer. Molecular Therapy. 21 (5), 986-994 (2013).
- Jopling, C. L., Yi, M., Lancaster, A. M., Lemon, S. M., Sarnow, P. Modulation of hepatitis C virus RNA abundance by a liver-specific microRNA. Science. 309 (5740), 1577-1581 (2005).
- Lanford, R. E., et al. Therapeutic silencing of microRNA-122 in primates with chronic hepatitis C virus infection. Science. 327 (5962), 198-201 (2010).
- Ucar, A., et al. The miRNA-212/132 family regulates both cardiac hypertrophy and cardiomyocyte autophagy. Nature Communications. 3, 1078 (2012).
- Zhu, X., et al. Identification of micro-RNA networks in end-stage heart failure because of dilated cardiomyopathy. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (9), 1173-1187 (2013).
- Bandiera, S., et al. Nuclear outsourcing of RNA interference components to human mitochondria. PLoS One. 6 (6), e20746 (2011).
- Barrey, E., et al. Pre-microRNA and mature microRNA in human mitochondria. PLoS One. 6 (5), e20220 (2011).
- Bian, Z., et al. Identification of mouse liver mitochondria-associated miRNAs and their potential biological functions. Cell Research. 20 (9), 1076-1078 (2010).
- Kren, B. T., et al. MicroRNAs identified in highly purified liver-derived mitochondria may play a role in apoptosis. RNA Biology. 6 (1), 65-72 (2009).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
- Molkentin, J. D., Jobe, S. M., Markham, B. E. Alpha-myosin heavy chain gene regulation: delineation and characterization of the cardiac muscle-specific enhancer and muscle-specific promoter. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 28 (6), 1211-1225 (1996).
- Poliseno, L., et al. A coding-independent function of gene and pseudogene mRNAs regulates tumour biology. Nature. 465 (7301), 1033-1038 (2010).
- Henao-Mejia, J., et al. The microRNA miR-181 is a critical cellular metabolic rheostat essential for NKT cell ontogenesis and lymphocyte development and homeostasis. Immunity. 38 (5), 984-997 (2013).
- Williams, A., Henao-Mejia, J., Harman, C. C., Flavell, R. A. miR-181 and metabolic regulation in the immune system. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 78, 223-230 (2013).
- Hori, D., et al. miR-181b regulates vascular stiffness age dependently in part by regulating TGF-beta signaling. PLoS One. 12 (3), e0174108 (2017).
- Ebert, M. S., Sharp, P. A. MicroRNA sponges: progress and possibilities. RNA. 16 (11), 2043-2050 (2010).
- Ma, L., et al. Therapeutic silencing of miR-10b inhibits metastasis in a mouse mammary tumor model. Nature Biotechnology. 28 (4), 341-347 (2010).
- Davis, S., Lollo, B., Freier, S., Esau, C. Improved targeting of miRNA with antisense oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 34 (8), 2294-2304 (2006).
- Davis, S., et al. Potent inhibition of microRNA in vivo without degradation. Nucleic Acids Research. 37 (1), 70-77 (2009).
- Elmen, J., et al. LNA-mediated microRNA silencing in non-human primates. Nature. 452 (7189), 896-899 (2008).
- Esau, C. C. Inhibition of microRNA with antisense oligonucleotides. Methods. 44 (1), 55-60 (2008).
- Stenvang, J., Kauppinen, S. MicroRNAs as targets for antisense-based therapeutics. Expert Opinion on Biological Therapy. 8 (1), 59-81 (2008).
- Lennox, K. A., Behlke, M. A. A direct comparison of anti-microRNA oligonucleotide potency. Pharmaceutical Research. 27 (9), 1788-1799 (2010).
- Lennox, K. A., Behlke, M. A. Chemical modification and design of anti-miRNA oligonucleotides. Gene Therapy. 18 (12), 1111-1120 (2011).
- van Rooij, E., Olson, E. N. MicroRNA therapeutics for cardiovascular disease: opportunities and obstacles. Nature Reviews. Drug Discovery. 11 (11), 860-872 (2012).
- Stenvang, J., Petri, A., Lindow, M., Obad, S., Kauppinen, S. Inhibition of microRNA function by antimiR oligonucleotides. Silence. 3 (1), 1 (2012).
- Levin, A. A. A review of the issues in the pharmacokinetics and toxicology of phosphorothioate antisense oligonucleotides. Biochimica et Biophysica Acta. 1489 (1), 69-84 (1999).
- Flynt, A. S., Li, N., Thatcher, E. J., Solnica-Krezel, L., Patton, J. G. Zebrafish miR-214 modulates Hedgehog signaling to specify muscle cell fate. Nature Genetics. 39 (2), 259-263 (2007).
- Kloosterman, W. P., Lagendijk, A. K., Ketting, R. F., Moulton, J. D., Plasterk, R. H. Targeted inhibition of miRNA maturation with morpholinos reveals a role for miR-375 in pancreatic islet development. PLoS Biology. 5 (8), e203 (2007).
- Martello, G., et al. MicroRNA control of Nodal signalling. Nature. 449 (7159), 183-188 (2007).
- Fabani, M. M., Gait, M. J. miR-122 targeting with LNA/2′-O-methyl oligonucleotide mixmers, peptide nucleic acids (PNA), and PNA-peptide conjugates. RNA. 14 (2), 336-346 (2008).
- Fabani, M. M., et al. Efficient inhibition of miR-155 function in vivo by peptide nucleic acids. Nucleic Acids Research. 38 (13), 4466-4475 (2010).
- Babar, I. A., et al. Nanoparticle-based therapy in an in vivo microRNA-155 (miR-155)-dependent mouse model of lymphoma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), E1695-E1704 (2012).
- Torres, A. G., et al. Chemical structure requirements and cellular targeting of microRNA-122 by peptide nucleic acids anti-miRs. Nucleic Acids Research. 40 (5), 2152-2167 (2012).
- Kent, O. A., McCall, M. N., Cornish, T. C., Halushka, M. K. Lessons from miR-143/145: the importance of cell-type localization of miRNAs. Nucleic Acids Research. 42 (12), 7528-7538 (2014).
