I Vivo Nanovector levering av en hjerte-spesifikke MicroRNA-svamp
Summary
Vev-spesifikke microRNA hemming er en teknologi som er underutviklet i feltet microRNA. Her beskriver vi en protokoll for vellykket hemme miR-181 microRNA familien i myoblast celler fra hjertet. Nanovector teknologi brukes til å levere en microRNA svamp som viser betydelig i vivo cardio-spesifikke miR-181 med familien hemming.
Abstract
MicroRNA (miRNA) er liten ikke-koding RNA som hemmer post-transcriptional budbringer RNA (mRNA) uttrykk. Menneskelige sykdommer som kreft og kardiovaskulær sykdom, har blitt vist å aktivere vev og/eller cellen-spesifikke miRNA uttrykk forbundet med sykdomsprogresjon. Hemming av miRNA uttrykk tilbyr muligheter for en terapeutisk intervensjon. Tradisjonelle tilnærminger å hemme miRNAs, ansette antagomir oligonucleotides, påvirker imidlertid bestemte miRNA funksjoner ved globale levering. Her presenterer vi en protokoll for cardio-spesifikke i vivo hemming av miR-181 familien i en rotte modell. En miRNA-svamp konstruksjon er utformet for å inkludere 10 gjentatte miR-181 bindende sekvenser. Cardio-spesifikke α-MHC selskapet er klonet i pEGFP ryggraden å kjøre cardio-spesifikke miR-181 miRNA-svamp uttrykket. Hvis du vil opprette en stabil celle er uttrykke miR-181-svamp, myoblast H9c2 celler transfekterte med den α-MHC-EGFP-miR-181-sponge konstruere og sortert etter fluorescens-aktivert celle sortering (FACs) i GFP positivt H9c2 celler som er kultivert med neomycin (G418). Etter stabil vekst i neomycin, monoklonale celle populasjoner er etablert av ekstra FACs og enkelt celle kloning. De resulterende myoblast H9c2-miR-181-svamp-GFP cellene exhibit tap av funksjon av miR-181 familiemedlemmer som vurdert gjennom økt uttrykk for miR-181 målet proteiner og sammenlignet H9c2 celler uttrykke en scramble fungerer ikke svamp. I tillegg utvikle vi en nanovector for systemisk levering av miR-181-svamp Konstruer av complexing positivt ladet liposomal nanopartikler og negativt ladet miR-181-svamp plasmider. I vivo avbildning av GFP avslører at flere hale blodåre injeksjoner av en nanovector over en tre-ukers periode, kan fremme en betydelig uttrykk for miR-181-svamp på cardio-spesifikk måte. Viktigere, er tap av miR-181 funksjonen observert i hjertet tissue men ikke i nyre eller leveren. MiRNA-svamp er en kraftig metode å hemme vev-spesifikke miRNA uttrykk. Kjører miRNA-svamp uttrykket fra en vev-spesifikke promoter gir spesifisitet for miRNA hemming, som kan være begrenset til en målrettet organ eller vev. Videre tillater kombinerer nanovector og miRNA-svamp teknologi en effektiv levering og vev-spesifikke miRNA hemming i vivo.
Introduction
De siste to tiårene, har det vært mange studier som har pekt på betydelig rollen som miRNAs i menneskelig sykdom. Resultatene fra en stor mengde litteratur viser unektelig betydningen av miRNAs i patofysiologien av sykdommer som kreft1 og hjerte-og karsykdommer2,3,4,5. For eksempel er miR-21 upregulated i mange kreftformer, som resulterer i en økt celle syklus og celle spredning6. I hepatitt C infeksjoner, miR-122 spiller en viktig rolle i replikering av virus7, og det har vist at hemming av miR-122 reduserer Virusmengden8. Hjerte-hypertrofi, miR-212/132 er upregulated i hjertet og er involvert i patologisk fenotypen9. Åpenbare betydningen av downregulation eller funksjonelle hemming av en upregulated miRNA antyder muligheter for terapeutisk utnytte miRNA biologi i nesten alle sykdommer.
Fire miR-181 familiemedlemmer, miR-181a/b/c/d, finnes i tre genomisk steder i det menneskelige genomet. Intronic regionen med et ikke-koding RNA vert (MIR181A1-HG) koder klyngen av miR-181-a/b-1. Intronic regionen av NR6A1 genet koder til miR-181-a/b-2. MiR-181-c/d klyngen ligger i en uncharacterized utskrift på kromosom 19. Alle miR-181 familiemedlemmer deler samme “frø” sekvens, og alle fire miR-181 familiemedlemmer kan potensielt regulere samme mRNA mål.
Vi3,4 og andre10 har understreket viktigheten av miR-181 familiemedlemmer under sluttstadiet hjertesvikt. Vi har også anerkjent at en miR – 181c oppregulering oppstår under patologiske forhold knyttet til en økt risiko for hjertesykdom, som type II diabetes, fedme og aldring3,4,5. Det har blitt postulert at overuttrykte av miR – 181c fører oksidativt stress som fører til hjerte-dysfunksjon4.
Flere grupper har antydet at miRNA finnes i mitokondrier11,12,13,14, men vi var de første til å demonstrere at miR – 181 c er avledet fra kjernefysiske genomet, behandlet, og senere translocated til mitokondrier i RISC3. Videre har vi oppdaget en lav uttrykk for miR-181a og miR-181b i mitokondrie rommet av hjertet5. Viktigere, har vi funnet at miR – 181c represses mt-COX1 mRNA uttrykket, og dermed demonstrere at miRNAs delta i mitokondrie genet regulering og endre mitokondrie funksjonen3,4.
Denne artikkelen beskriver metodene som kreves for å utforme en miRNA-svamp å slå ned hele miR-181 familien i cardiomyocytes. Videre skissere vi en protokoll for programmet i vivo av miR-181-svampen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne artikkelen beskrives design og syntese av miRNA-svampen og vist hvordan vev-spesifikke uttrykk for svamp er et kraftig verktøy for å hemme vev-spesifikke miRNA familie uttrykk.
Vi har vist at en miR-181 familie målretting svamp kan klones i et uttrykk plasmider med en hjerte-spesifikke promoter. Plasmider effektivt kan pakkes inn i en nanovector partikkel for levering i vitro og i vivo med electroporation eller en hale blodåre injeksjon, henholdsvis (<strong class="…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Anthony K. L. Leung avdeling for biokjemi og molekylærbiologi, Bloomberg School of Public Health, Johns Hopkins University for hans teknisk hjelpe med å utforme den miR-181-svamp konstruere. Vi takker også Polina Sysa-Shah og Kathleen Gabrielson Institutt for molekylær og komparative Pathobiology, Johns Hopkins medisinske institusjoner for deres teknisk assistanse av i vivo -tenkelig miRNA-svamp levering.
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra NIH, HL39752 (til Charles Steenbergen) og en forsker Development Grant fra American Heart Association 14SDG18890049 (til Samarjit Das). Rotte cardio-spesifikke selskapet ble sjenerøst gitt av Jeffery D. Molkentin ved Cincinnati Children’s Hospital.
Materials
| pEGFP-C1 vector | Addgene | 6084-1 | |
| In-fusion | Clontech | 121416 | |
| QIAprep Miniprep | Qiagen | 27104 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| miR-181-sponge synthesis | Introgen GeneArt | custome made | |
| PCR primers | Integrated DNA Technologies | custome | |
| EcoRI enzymes | New Endland Biolabs | R0101S | |
| KpnI enzymes | New Endland Biolabs | R0142S | |
| Rapid DNA Ligation Kit | Sigma-Aldrich | 11635379001 | |
| H9c2 cells | ATCC | CRL-1446 | |
| DMEM Media | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10082139 | |
| Nucleofector 2b Device | Lonza | AAB-1001 | |
| Nucleofector Kits for H9c2 (2-1) | Lonza | VCA-1005 | |
| G418, Geneticin | Thermo Fisher Scientific | 11811023 | |
| FACSAria II Flow cytometer | BD Bioscience | 644832 | |
| Branson 450 sonifier | Marshall Scientific | EDP 100-214-239 | |
| The Xenogen IVIS Spectrum optical imaging device | Caliper Life Sciences | ||
| Anti-MTCO1 antibody | Abcam | ab14705 | |
| α-tubulin antibody | Abcam | ab7291 | |
| Sequoia C256 ultrasound system | Siemens |
References
- Hammond, S. M. microRNA detection comes of age. Nat Methods. 3 (1), 12-13 (2006).
- van Rooij, E., Olson, E. N. MicroRNAs: powerful new regulators of heart disease and provocative therapeutic targets. The Journal of Clinical Investigation. 117 (9), 2369-2376 (2007).
- Das, S., et al. Nuclear miRNA regulates the mitochondrial genome in the heart. Circulation Research. 110 (12), 1596-1603 (2012).
- Das, S., et al. miR-181c regulates the mitochondrial genome, bioenergetics, and propensity for heart failure in vivo. PLoS One. 9 (5), e96820 (2014).
- Das, S., et al. Divergent effects of miR-181 family members on myocardial function through protective cytosolic and detrimental mitochondrial microRNA targets. Journal of the American Heart Association. 6 (3), e004694 (2017).
- Sicard, F., Gayral, M., Lulka, H., Buscail, L., Cordelier, P. Targeting miR-21 for the therapy of pancreatic cancer. Molecular Therapy. 21 (5), 986-994 (2013).
- Jopling, C. L., Yi, M., Lancaster, A. M., Lemon, S. M., Sarnow, P. Modulation of hepatitis C virus RNA abundance by a liver-specific microRNA. Science. 309 (5740), 1577-1581 (2005).
- Lanford, R. E., et al. Therapeutic silencing of microRNA-122 in primates with chronic hepatitis C virus infection. Science. 327 (5962), 198-201 (2010).
- Ucar, A., et al. The miRNA-212/132 family regulates both cardiac hypertrophy and cardiomyocyte autophagy. Nature Communications. 3, 1078 (2012).
- Zhu, X., et al. Identification of micro-RNA networks in end-stage heart failure because of dilated cardiomyopathy. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (9), 1173-1187 (2013).
- Bandiera, S., et al. Nuclear outsourcing of RNA interference components to human mitochondria. PLoS One. 6 (6), e20746 (2011).
- Barrey, E., et al. Pre-microRNA and mature microRNA in human mitochondria. PLoS One. 6 (5), e20220 (2011).
- Bian, Z., et al. Identification of mouse liver mitochondria-associated miRNAs and their potential biological functions. Cell Research. 20 (9), 1076-1078 (2010).
- Kren, B. T., et al. MicroRNAs identified in highly purified liver-derived mitochondria may play a role in apoptosis. RNA Biology. 6 (1), 65-72 (2009).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
- Molkentin, J. D., Jobe, S. M., Markham, B. E. Alpha-myosin heavy chain gene regulation: delineation and characterization of the cardiac muscle-specific enhancer and muscle-specific promoter. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 28 (6), 1211-1225 (1996).
- Poliseno, L., et al. A coding-independent function of gene and pseudogene mRNAs regulates tumour biology. Nature. 465 (7301), 1033-1038 (2010).
- Henao-Mejia, J., et al. The microRNA miR-181 is a critical cellular metabolic rheostat essential for NKT cell ontogenesis and lymphocyte development and homeostasis. Immunity. 38 (5), 984-997 (2013).
- Williams, A., Henao-Mejia, J., Harman, C. C., Flavell, R. A. miR-181 and metabolic regulation in the immune system. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 78, 223-230 (2013).
- Hori, D., et al. miR-181b regulates vascular stiffness age dependently in part by regulating TGF-beta signaling. PLoS One. 12 (3), e0174108 (2017).
- Ebert, M. S., Sharp, P. A. MicroRNA sponges: progress and possibilities. RNA. 16 (11), 2043-2050 (2010).
- Ma, L., et al. Therapeutic silencing of miR-10b inhibits metastasis in a mouse mammary tumor model. Nature Biotechnology. 28 (4), 341-347 (2010).
- Davis, S., Lollo, B., Freier, S., Esau, C. Improved targeting of miRNA with antisense oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 34 (8), 2294-2304 (2006).
- Davis, S., et al. Potent inhibition of microRNA in vivo without degradation. Nucleic Acids Research. 37 (1), 70-77 (2009).
- Elmen, J., et al. LNA-mediated microRNA silencing in non-human primates. Nature. 452 (7189), 896-899 (2008).
- Esau, C. C. Inhibition of microRNA with antisense oligonucleotides. Methods. 44 (1), 55-60 (2008).
- Stenvang, J., Kauppinen, S. MicroRNAs as targets for antisense-based therapeutics. Expert Opinion on Biological Therapy. 8 (1), 59-81 (2008).
- Lennox, K. A., Behlke, M. A. A direct comparison of anti-microRNA oligonucleotide potency. Pharmaceutical Research. 27 (9), 1788-1799 (2010).
- Lennox, K. A., Behlke, M. A. Chemical modification and design of anti-miRNA oligonucleotides. Gene Therapy. 18 (12), 1111-1120 (2011).
- van Rooij, E., Olson, E. N. MicroRNA therapeutics for cardiovascular disease: opportunities and obstacles. Nature Reviews. Drug Discovery. 11 (11), 860-872 (2012).
- Stenvang, J., Petri, A., Lindow, M., Obad, S., Kauppinen, S. Inhibition of microRNA function by antimiR oligonucleotides. Silence. 3 (1), 1 (2012).
- Levin, A. A. A review of the issues in the pharmacokinetics and toxicology of phosphorothioate antisense oligonucleotides. Biochimica et Biophysica Acta. 1489 (1), 69-84 (1999).
- Flynt, A. S., Li, N., Thatcher, E. J., Solnica-Krezel, L., Patton, J. G. Zebrafish miR-214 modulates Hedgehog signaling to specify muscle cell fate. Nature Genetics. 39 (2), 259-263 (2007).
- Kloosterman, W. P., Lagendijk, A. K., Ketting, R. F., Moulton, J. D., Plasterk, R. H. Targeted inhibition of miRNA maturation with morpholinos reveals a role for miR-375 in pancreatic islet development. PLoS Biology. 5 (8), e203 (2007).
- Martello, G., et al. MicroRNA control of Nodal signalling. Nature. 449 (7159), 183-188 (2007).
- Fabani, M. M., Gait, M. J. miR-122 targeting with LNA/2′-O-methyl oligonucleotide mixmers, peptide nucleic acids (PNA), and PNA-peptide conjugates. RNA. 14 (2), 336-346 (2008).
- Fabani, M. M., et al. Efficient inhibition of miR-155 function in vivo by peptide nucleic acids. Nucleic Acids Research. 38 (13), 4466-4475 (2010).
- Babar, I. A., et al. Nanoparticle-based therapy in an in vivo microRNA-155 (miR-155)-dependent mouse model of lymphoma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), E1695-E1704 (2012).
- Torres, A. G., et al. Chemical structure requirements and cellular targeting of microRNA-122 by peptide nucleic acids anti-miRs. Nucleic Acids Research. 40 (5), 2152-2167 (2012).
- Kent, O. A., McCall, M. N., Cornish, T. C., Halushka, M. K. Lessons from miR-143/145: the importance of cell-type localization of miRNAs. Nucleic Acids Research. 42 (12), 7528-7538 (2014).
