قاعدة البيانات--تسترشد التدفق الخلوي لتقييم نضج الخلية النقوي نخاع العظام
Summary
من الصعب تشخيص حركة الديمقراطيين الاشتراكيين في غياب المعايير المورفولوجية أو سيتوجينيتيكس غير مفيدة. MFC يمكن أن تساعد في تحسين عملية التشخيص حركة الديمقراطيين الاشتراكيين. لتصبح مفيدة للممارسة السريرية، يجب أن تعتمد التحليل MFC على المعلمات مع خصوصية وحساسية كافية، وينبغي أن تكون البيانات قابل لإعادة الإنتاج بين مختلف العاملين.
Abstract
ووضعت مجموعة عمل بدأت داخل الرابطة الفرنسية الخلوي (الاتحاد الآسيوي) من أجل تنسيق تطبيق مولتيباراميتير التدفق الخلوي (MFC) لتشخيص الأمراض النقوي في فرنسا. كان البروتوكول المعروضة هنا المتفق عليها وتطبيقها بين عام 2013 في أيلول/سبتمبر وتشرين الثاني/نوفمبر عام 2015 في ستة مختبرات التشخيص الفرنسية (مستشفيات جامعة سانت إتيان، غرينوبل، كليرمون فران، نيس، وليل ومعهد Paoli-كالميتيس في مرسيليا) ويسمح بتوحيد اقتناء البيانات وإعداد عينة نخاع العظام. ووضعت ثلاث قواعد بيانات النضج العَدلات، مونوسيتيك، والأنساب محمر مع نخاع العظام من المانحين “صحية” الأفراد (الأفراد دون أي دليل على وجود مرض المكونة للدم). ينبغي أن تكون طريقة قوية للتحليل لكل النسب النقوي المطبقة للاستخدام التشخيصي الروتيني. يمكن تحليلها بنفس الطريقة الحالات الجديدة ومقارنتها بقواعد البيانات المعتادة. وهكذا، يمكن التعرف على التشوهات المظهرية الكمي والنوعي وتلك المذكورة أعلاه 2SD مقارنة مع بيانات عينات نخاع العظم الطبيعي ينبغي أن يدل على علم الأمراض. أن القيد الرئيسي هو تباين أعلى بين البيانات يتحقق باستخدام الأجسام المضادة التي تم الحصول عليها بطرق تعتمد على تقنيات هيبريدوما والمستخدمة حاليا في التشخيص السريري. وضع معايير تقنية التحقق من صحة البيانات المكتسبة قد تساعد في تحسين الأداة المساعدة من MFC لتشخيص حركة الديمقراطيين الاشتراكيين. ويتطلب إنشاء هذه المعايير التحليل مقابل قاعدة بيانات. أن الحد الذاتية المحقق في تحليل البيانات ميزة هامة لهذا الأسلوب.
Introduction
في غياب المظهرية علامات محددة للتغيرات ديسبلاستيك التي تحدث في خلايا النقوي أثناء بدء حركة الديمقراطيين الاشتراكيين، والتقدم، تم اقتراح نهج جديد في السنوات الأخيرة استناداً إلى تقييم مسارات النضج (التعبير غيرت من النقوي المستضدات خلال إنتاج خلايا ناضجة النقوي) أو التوزيع غير طبيعي لأنواع مختلفة من الخلايا داخل نخاع العظم (بي أم) خلية المقصورات1،2.
تقدم هذه المقالة طريقة جديدة لتطبيق MFC موحدة من أجل الكشف عن التغييرات ديسبلاستيك في المقصورات خلية النقوي BM تتصل myelodysplastic المتلازمات (حركة الديمقراطيين الاشتراكيين) أو غيرها من أمراض الدم النقوي. وتبين هذه الدراسة أيضا مدى فائدة استخدام قواعد بيانات النضج لتحليل البيانات MFC.
توحيد نماذج إعداد الإجراء والحصول على البيانات، والتحليل باستخدام قواعد البيانات سوف تسمح بتحديد شذوذ المظهرية الأكثر صلة تتعلق بالتغييرات ديسبلاستيك في الخلايا BM النقوي. ولذلك، مجموعات فرعية مختارة إحصائيا استناداً إلى صيغ المسمى جيدا والمعترف بها جيدا (فاصل السكان تلقائي (الجزائرية) مخططات ورسوم بيانية ومؤامرات دوت) مطلوبة من أجل وضع استراتيجية تحليل التي يمكن استخدامها في التحليل اللاحق جولات. اكتشاف تشوهات المظهرية قوية في حركة الديمقراطيين الاشتراكيين سيخفف التشخيص في الحالات مع أو دون الحد الأدنى من خلل التنسج المورفولوجية ودون أبرانسيس الخلوية الوراثية. يمكن تبسيط تحديد المعلمات التمييزية السماح للحد الألواح إيمونوفينوتيبيك الحالي عشرات2، يسمح بتطبيقها في مختبرات علم الأمراض السريرية.
هذا الأسلوب يحد تفسيرات ذاتية لبيانات الخلوي، وقد تم الإشارة في حركة الديمقراطيين الاشتراكيين تشخيص3. هذه الخطوة شرط أساسي لتطوير أدوات مؤتمتة لتجهيز وتحليل تدفق البيانات4.
حركة الديمقراطيين الاشتراكيين تضم مجموعة غير متجانسة من الاضطرابات الاستنساخ من الخلية الجذعية المكونة للدم (HSC) التي تتعاون بها طفرات سبليسيوسومي مع المعدلات جينية محددة تسفر عن النمط الظاهري حركة الديمقراطيين الاشتراكيين. ومن المعروف الآن أن، جنبا إلى جنب مع الطفرات HSC، آليات أخرى تشارك في حركة الديمقراطيين الاشتراكيين الفيزيولوجيا المرضية، مثل التهاب المناعي بوساطة الشاذة والتفاعلات بين هسكس الخبيثة والمكرويه اللحمية بي أم. بيد أن هذه الآليات لا تزال غير مفهومة. يجعل التغايرية السريرية والبيولوجية على نطاق واسع لحركة الديمقراطيين الاشتراكيين بالتشخيص واختيار العلاج الأمثل تحديا. في العقد الماضي، وقد أظهرت الدراسات المتعددة أن MFC غالباً أكثر حساسية في الكشف عن خلل التنسج2 من التشكل، ولكن القيود التقنية والاقتصادية تجعل من الصعب على توحيد، مع النتائج غالباً ما اعتماداً على هذه التقنية تجربة مترجم3. وبالإضافة إلى ذلك، من غير الواضح كيف MFC يمكن ترجيح كفة الميزان نحو حركة الديمقراطيين الاشتراكيين في الحالات مع أو بدون الحد الأدنى من خلل التنسج المورفولوجية وفي غياب الاختلالات الخلوية الوراثية، أو في الحالات الحدية مثل هيبوسيلولار حركة الديمقراطيين الاشتراكيين، مع عد انفجار منخفضة، من غيرها BM غير الاستنساخ اضطرابات مثل فشل نخاع العظم (أي.، فقر الدم اللاتنسجي). كذلك ما زال من الصعب التفريق بين الحالات الحدية لحركة الديمقراطيين الاشتراكيين مع وجود فائض انفجارات من سرطان الدم النقوي الحاد (مكافحة غسل الأموال). ولجميع هذه الأسباب، لا تدمج المبادئ التوجيهية السريرية الاختبار MFC إلى التشخيص النهائي حركة الديمقراطيين الاشتراكيين. في عام 2011، أوصى الولايات المتحدة وطنية شاملة سرطان شبكة (NCCN) MFC لتقدير النسبة المئوية للخلايا CD34 +، والكشف عن استنساخ انتيابيه الانتيابي، ووجود من استنساخ خلايا T السامة للخلايا في حركة الديمقراطيين الاشتراكيين هيبوسيلولار5. هاتين الحالتين الأخير ينطوي أيضا على هدف علاجي لأن البيانات السريرية أظهرت استجابة جيدة لهؤلاء المرضى للعلاج كآبته6. سرد المبادئ التوجيهية NCCN 2017، مستشهداً بتوصيات الفريق العامل الدولي (الفريق العامل)، إيمونوفينوتيبينج الشاذة الكشف بواسطة MFC بين المعايير المشتركة لتشخيص حركة الديمقراطيين الاشتراكيين، ولكن دون إجراء أي مواصفات6. وباﻹضافة إلى ذلك، تصنيف منظمة الصحة العالمية نشرت مؤخرا ينص على أن النتائج MFC وحدها ليست كافية لإثبات تشخيص الأولية لحركة الديمقراطيين الاشتراكيين في غياب بيانات قاطعة المورفولوجية و/أو الخلوية الوراثية7. ومع ذلك، يمكن استخدام MFC كاختبار إضافية تظهر التقلبات خلية النقوي أنماط النضوج وقياس “المسافة من العادي” لمريض في وقت محدد في مسار المرض.
ينطبق هذا الأسلوب في المختبرات السريرية المهتمة بالأمر في تقييم خلل التنسج في الخلايا BM النقوي استخدام MFC إيمونوفينوتيبينج، بغية تحسين التشخيص في حركة الديمقراطيين الاشتراكيين أو غيرها من اضطرابات النقوي مع شذوذ ديسبلاستيك.
Protocol
Representative Results
Discussion
نوعية أسبيراتي بي أم يمكن أن تؤثر على النتائج النهائية. تخفيف الدم أسبيراتي بي أم يمكن أن تشوه توزيع الخلايا في مراحل مختلفة من النضج بسبب الغياب من فروعه أو خلايا السلائف. ربما تستخدم الجزء الأكبر ليسينج الأسلوب قد تساعد في تطبيع تبين BM لتخفيف الدم في تحليل تدفق سيتوميتريك. وبالإضافة إلى ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الأجسام المضادة التي استخدمت في هذه الدراسة قدمت “العلوم دينار بحريني”. الكتاب أود أن أشكر زميلهم، الدكتور باسكال فلاندرين-جريستا، من قسم البيولوجيا الجزيئية، مختبر أمراض الدم، جامعة مستشفى سانت إتيان “، فرنسا”، الذين قدموا الخبرة لتفسير البيانات خ ع و للمرة الثانية حالة حركة الديمقراطيين الاشتراكيين. الكتاب شاكرون للطبيب هيماتولوجيستس للاهتمام والمشاركة في هذه الدراسة، والمرضى والجهات المانحة صحية لموافقتها على المشاركة في هذه الدراسة. الكتاب أيضا يود أن يشكر مؤسسة “Les بعثة الاتحاد الأفريقي دي ريمي” للدعم المالي للنشر.
Materials
| BD FACSCanto II flow-cytometer | BD Biosciences, CA, USA | SN: V33896301336 | 3-laser, 4-2-2 configuration, Filters and mirrors details: https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCanto_II_FilterGuide.pdf |
| Awel C48-R Centrifuge | AWEL Industries, FR | SN: 910120016; Model No: 320002001 | low speed centrifuges; capacity 60 FACS tubes |
| Pipetts of 10µl and 200µl | |||
| Pasteur pipettes | |||
| 15 mL Falcon tubes | |||
| polypropylene tube for FACS | |||
| Mouse Anti-Human HLA-DR | BD Biosciences, CA, USA | 655874 | clone L243 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome Horizon V450 (Ex max 404 nm/ Em max 448 nm) |
| Mouse Anti-Human CD45 | BD Biosciences, CA, USA | 560777 | clone HI30 Mouse IgG1, κ Fluorochrome Horizon V500 (Ex max 415 nm/ Em max 500 nm) |
| Mouse Anti-Human CD16 | BD Biosciences, CA, USA | 656146 | clone CLB/fcGran1 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm) |
| Mouse Anti-Human CD13 | BD Biosciences, CA, USA | 347406 | clone L138 Mouse BALB/c X C57BL/6 IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
| Mouse Anti-Human CD34 | BD Biosciences, CA, USA | 347222 | clone 8G12 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PerCP-Cy5.5 (Ex max 482 nm/ Em max 678 nm) |
| Mouse Anti-Human CD117 | BD Biosciences, CA, USA | 339217 | clone 104D2 Mouse BALB/c IgG1 Fluorochrome PE-Cy7 (Ex max 496 nm/ Em max 785 nm) |
| Mouse Anti-Human CD11b | BD Biosciences, CA, USA | 333143 | clone D12 Mouse BALB/c IgG2a, κ D12, Fluorochrome APC (Ex max 650 nm/ Em max 660nm |
| Mouse Anti-Human CD10 | BD Biosciences, CA, USA | 646783 | clone HI10A Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm) |
| Mouse Anti-Human CD35 | BD Biosciences, CA, USA | 555452 | clone E11 Mouse IgG1, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm) |
| Mouse Anti-Human CD64 | BD Biosciences, CA, USA | 644385 | clone 10.1 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
| Mouse Anti-Human CD300e | Immunostep | IREM2A-T100 | clone UP-H2 Mouse BALB/c IgG1, k Fluorochrome APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
| Mouse Anti-Human CD14 | BD Biosciences, CA, USA | 641394 | clone MoP9 Mouse BALB/c IgG2b, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm) |
| Mouse Anti-Human CD36 | BD Biosciences, CA, USA | 656151 | clone CLB-IVC7 Mouse IgG1, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm) |
| Mouse Anti-Human CD105 | BD Biosciences, CA, USA | 560839 | clone 266 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
| Mouse Anti-Human CD33 | 345800 | clone P67.6 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
|
| Mouse Anti-Human CD71 | BD Biosciences, CA, USA | 655408 | clone M-A712 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm) |
| Lysing Solution 10X Concentrate (IVD) | BD Biosciences, CA, USA | 349202 | |
| FACSFlow Sheath Fluid | BD Biosciences, CA, USA | 342003 | |
| FACSDiva CS&T IVD beads | BD Biosciences, CA, USA | 656046 | |
| RAINBOW CALIBRATION PARTICLES, 8 PEAKS | Cytognos, Salamanca, Spain | SPH-RCP-30-5A | lots EAB01, EAC01, EAD05, EAE01, EAF01, EAG01, EAH01, EAI01, EAJ01, EAK01 |
| Compensation Particles Multicolor CompBeads(CE/IVD) | BD Biosciences, CA, USA | ref. #51-90-9001229 + #51-90-9001291 | |
| Diva software versions 6.1.2 and 6.1.3 | BD Biosciences, CA, USA | ||
| Phosphate buffered saline tablets | R&D Systems, Minneapolis, USA | 5564 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, France | A9647 | |
| Sodium azide 99% | Sigma-Aldrich, France | 199931 | |
| Infinicyt software version 1.8.0.e | Cytognos, Salamanca, Spain |
References
- Orfao, A., Ortuño, F., de Santiago, M., Lopez, A., San Miguel, J. Immunophenotyping of Acute Leukemias and Myelodysplastic Syndromes. Cytometry Part A. 58, 62-71 (2004).
- Porwit, A., et al. Revisiting guidelines for integration of flow cytometry results in the WHO classification of Myelodysplastic Syndromes – proposal from the International/European LeukemiaNet Working Group for Flow Cytometry in MDS (IMDSFlow). Leukemia. 28 (9), 1793-1798 (2014).
- Westers, M. T., et al. Implementation of flow cytometry in the diagnostic work-up of myelodysplastic syndromes in a multicenter approach: Report from the Dutch Working Party on Flow Cytometry in MDS. Leukemia Research. 36, 422-430 (2012).
- Meehan, S., et al. AutoGate: automating analysis of flow cytometry data. Immunologic Research. 58, 218-223 (2014).
- Greenberg, P. L., et al. NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology: myelodysplastic syndromes. Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 9, 30-56 (2011).
- Greenberg, P. L., et al. Myelodysplastic Syndromes, Version 2.2017, Clinical Practice Guidelines in Oncology. Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 15, (2017).
- Swerdlow, S. H., et al. . WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. Revised 4th Edition. (2), 86-128 (2017).
- . https://lists.purdue.edu/pipermail/cytometry/2009-March/036889.html Available from: https://lists.purdue.edu/pipermail/cytometry/2009-March/036889.html (2018)
- . . Composition of EuroFlow panels and technical information on reagents Version 1.5. , (2017).
- . . EuroFlow Standard Operating Procedure (SOP) for sample preparation and staining Version 1.2.1. , (2015).
- Kalina, T., et al. EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols. Leukemia. 26, 1986-2010 (2012).
- van Dongen, J. J. M., et al. EuroFlow antibody panels for standardized n-dimensional flow cytometric immunophenotyping of normal, reactive and malignant leukocytes. Leukemia. 26, 1908-1975 (2012).
- Matarraz, S. Introduction to the Diagnosis and Classification of Monocytic-Lineage Leukemias by Flow Cytometry. Cytometry Part B (Clinical Cytometry). 92 (3), 218-227 (2015).
- Westers, M. T. Immunophenotypic analysis of erythroid dysplasia in myelodysplastic syndromes. A report from the IMDSFlow working group). Haematologica. 102, 308-319 (2017).
- Shen, Q., et al. Flow cytometry immunophenotypic findings in chronic myelomonocytic leukemia and its utility in monitoring treatment response. European Journal of Haematology. 95, 168-176 (2015).
