数据库引导流式细胞术评价骨髓细胞成熟

Summary

mds 诊断是困难的, 在没有形态学标准或非信息细胞遗传学。mfc 可以帮助优化 mds 诊断过程。为了对临床实践有用, mfc 分析必须基于具有足够特异性和敏感性的参数, 数据应在不同的操作人员之间重现。

Abstract

在法国细胞术协会 (afc) 内成立了一个工作组, 以协调多参数流式细胞术 (mfc) 在法国骨髓疾病诊断中的应用。这里介绍的议定书是在2013年9月至2015年11月期间在六个法国诊断实验室 (圣艾蒂安、格雷诺布尔、克莱蒙-费朗、尼斯、里尔和保利-卡尔特斯研究所) 商定并应用的。马赛), 并允许骨髓样品制备和数据采集的标准化。三个成熟数据库被开发了中性粒细胞, 单核细胞和红血球系与骨髓从 “健康” 捐献者 (个人没有任何证据的造血疾病)。对于每个髓系的可靠分析方法应该适用于常规诊断使用。可以以相同的方式分析新案例, 并与通常的数据库进行比较。因此, 定量和定性表型异常可以被确定, 那些超过2sd 的人相比, 正常骨髓样本的数据应被视为指示病理。主要的局限性是使用基于杂交瘤技术的方法获得的单克隆抗体获得的数据与目前用于临床诊断的数据之间的差异较高。为所获得的数据设置技术验证标准可能有助于提高 mfc 在 mds 诊断中的效用。制定这些标准需要对数据库进行分析。减少数据分析中的研究者主体性是该方法的一个重要优点。

Introduction

在 mds 启动和进展过程中, 没有特定于骨髓细胞增生异常变化的表型标记的情况下, 近年来在评估成熟途径 (表达改变) 的基础上, 提出了一种新的方法。在生产成熟髓细胞的过程中, 或在骨髓 (bm) 细胞隔间 1,²内不同细胞类型的异常分布^{的髓抗原.}

本文提出了一种新的方法, 标准化应用 mfc, 以检测与骨髓增生异常综合征 (mds) 或其他骨髓血液学疾病有关的 bm 骨髓细胞隔间的增生异常变化。本研究还显示了使用成熟数据库进行 mfc 数据分析的效用。

样品制备程序的标准化、数据采集和使用数据库进行分析, 将有助于识别与 bm 骨髓细胞增生异常变化有关的最相关的表型异常。因此, 在开发可用于后续分析的分析策略时, 需要基于标记良好且公认的格式 (自动人口分离器 (aps) 图、直方图和点图) 进行统计选择的子集轮。mds 中强健表型异常的发现将在有或没有最小形态发育不良和没有细胞遗传学异常的病例中缓解诊断。识别允许减少免疫表型面板的歧视性参数可以简化目前的分数², 使其在临床病理实验室的适用性。

这种方法限制了细胞学数据的主观解释, 正如 mds 诊断³中所表明的那样。此步骤是开发用于处理和分析流数据的自动化工具^{的先决条件 4}。

mds 包括一组异质性克隆造血干细胞 (hsc) 疾病, 其中牙代突变与特定的表观修饰语结合生成 mds 苯型。现在人们知道, 随着 hsc 突变, 其他机制也参与了 mds 病理生理学, 如异常免疫介导的炎症和恶性 hsc 与 bm 基质微环境之间的相互作用。然而, 对这些机制的了解仍然很少。mds 广泛的临床和生物学异质性使得诊断和选择最佳治疗方法成为一个挑战。在过去的十年里, 多项研究表明, mfc 在检测发育不良2方面往往比形态学更敏感, 但技术和经济上的限制使这一技术难以标准化, 其结果往往取决于口译人员的经验³。此外, 目前尚不清楚 mfc 如何在有或没有最小形态发育不良的情况下, 在没有细胞遗传学异常的情况下, 或在其他非克隆 bm 的低爆炸计数的低细胞 mds 等边缘病例中, 将天平向 mds 倾斜骨髓衰竭 (即再生障碍性贫血) 等疾病。在爆炸过多的情况下, 也很难区分 mds 的边缘病例和急性髓系白血病 (aml)。由于所有这些原因, 临床指南没有将 mfc 测试集成到 mds 最终诊断中。2011年, 美国国家综合癌症网络 (nccn) 推荐 mfc 用于估计 cd34+ 细胞的百分比, 检测阵发性夜间血红蛋白尿克隆, 以及细胞下 mds 5 中是否存在细胞毒性 t 细胞克隆.这两种情况后两种情况也涉及治疗目标, 因为临床数据显示, 这些患者对免疫抑制治疗有很好的反应^.2017年 nccn 指南引用了国际工作组 (iwg) 的建议, 将 mfc 异常免疫表型检测列为 mds 诊断的共同标准, 但没有制定任何规格⁶。此外, 最近公布的世卫组织分类规定, 仅有 mfc 发现不足以在没有结论性形态和/或细胞遗传学数据^的情况下确定 mds 的初步诊断7。然而, mfc 可以作为一个额外的测试, 显示骨髓细胞成熟模式的失调, 并量化患者在疾病过程中的特定时间 “与正常的距离”。

该方法适用于有兴趣用 mfc 免疫表型评估 bm 骨髓细胞发育不良的临床实验室, 以完善 mds 或其他骨髓异常异常疾病的诊断。

Protocol

以下议定书已得到法国圣艾蒂安大学医院 “独立道德委员会” (独立道德委员会) 的批准。 1. 细胞仪设置 注: 细胞仪设置是根据法国流量建议, 根据欧洲流程序 “欧洲流标准操作协议 (sop) 的仪器设置和补偿 (https://www.euroflow.org/usr/pub/protocols.php)。 每月仪器设置 打开细胞仪。确保所有液体水平都是适当的, 并打开 diva 6.1.3。执行流体启…

Representative Results

研究包括在 k-edta 抗凝剂中采集的 54个 bm 样品。在没有任何患者信息的情况下, 对 mfc 数据进行了分析。回顾性研究显示, bm 样本来自7个健康捐献者 (5名男性和2名女性, 中位年龄为 47.4 [35-48], 11 人没有造血疾病的证据 (8名男性和3名女性, 中位年龄为 57.9 [35-72]) 和36例。 病理情况: 贫血和肌酐水平低1例, 贫血3例, 肌酐水平高, 贫血8例, 维生素 b12 缺乏引起贫血1例, 贫血4例, 贫血…

Discussion

bm 吸气的质量可能会对最终结果产生影响。bm 吸气的血液稀释会由于没有祖细胞或前体细胞而扭曲不同成熟阶段细胞的分布。在流式细胞仪分析中, 采用大容量裂解法可能有助于 bm 吸气液的正常化, 用于血液稀释。此外, 流动细胞学评价 bm 骨髓发育不良的关键步骤是样品处理和染色、数据采集和解释^2,3。在 bm 收获后, 样品处理和染色应进行至72小时。数?…

Materials

BD FACSCanto II flow-cytometer	BD Biosciences, CA, USA	SN: V33896301336	3-laser, 4-2-2 configuration, Filters and mirrors details: https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCanto_II_FilterGuide.pdf
Awel C48-R Centrifuge	AWEL Industries, FR	SN: 910120016; Model No: 320002001	low speed centrifuges; capacity 60 FACS tubes
Pipetts of 10µl and 200µl
Pasteur pipettes
15 mL Falcon tubes
polypropylene tube for FACS
Mouse Anti-Human HLA-DR	BD Biosciences, CA, USA	655874	clone L243 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome Horizon V450 (Ex max 404 nm/ Em max 448 nm)
Mouse Anti-Human CD45	BD Biosciences, CA, USA	560777	clone HI30 Mouse IgG1, κ Fluorochrome Horizon V500 (Ex max 415 nm/ Em max 500 nm)
Mouse Anti-Human CD16	BD Biosciences, CA, USA	656146	clone CLB/fcGran1 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)
Mouse Anti-Human CD13	BD Biosciences, CA, USA	347406	clone L138 Mouse BALB/c X C57BL/6 IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD34	BD Biosciences, CA, USA	347222	clone 8G12 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PerCP-Cy5.5 (Ex max 482 nm/ Em max 678 nm)
Mouse Anti-Human CD117	BD Biosciences, CA, USA	339217	clone 104D2 Mouse BALB/c IgG1 Fluorochrome PE-Cy7 (Ex max 496 nm/ Em max 785 nm)
Mouse Anti-Human CD11b	BD Biosciences, CA, USA	333143	clone D12 Mouse BALB/c IgG2a, κ D12, Fluorochrome APC (Ex max 650 nm/ Em max 660nm
Mouse Anti-Human CD10	BD Biosciences, CA, USA	646783	clone HI10A Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)
Mouse Anti-Human CD35	BD Biosciences, CA, USA	555452	clone E11 Mouse IgG1, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)
Mouse Anti-Human CD64	BD Biosciences, CA, USA	644385	clone 10.1 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD300e	Immunostep	IREM2A-T100	clone UP-H2 Mouse BALB/c IgG1, k Fluorochrome APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD14	BD Biosciences, CA, USA	641394	clone MoP9 Mouse BALB/c IgG2b, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)
Mouse Anti-Human CD36	BD Biosciences, CA, USA	656151	clone CLB-IVC7 Mouse IgG1, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)
Mouse Anti-Human CD105	BD Biosciences, CA, USA	560839	clone 266 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD33		345800	clone P67.6 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)
Mouse Anti-Human CD71	BD Biosciences, CA, USA	655408	clone M-A712 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)
Lysing Solution 10X Concentrate (IVD)	BD Biosciences, CA, USA	349202
FACSFlow Sheath Fluid	BD Biosciences, CA, USA	342003
FACSDiva CS&T IVD beads	BD Biosciences, CA, USA	656046
RAINBOW CALIBRATION PARTICLES, 8 PEAKS	Cytognos, Salamanca, Spain	SPH-RCP-30-5A	lots EAB01, EAC01, EAD05, EAE01, EAF01, EAG01, EAH01, EAI01, EAJ01, EAK01
Compensation Particles Multicolor CompBeads(CE/IVD)	BD Biosciences, CA, USA	ref. #51-90-9001229 + #51-90-9001291
Diva software versions 6.1.2 and 6.1.3	BD Biosciences, CA, USA
Phosphate buffered saline tablets	R&D Systems, Minneapolis, USA	5564
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich, France	A9647
Sodium azide 99%	Sigma-Aldrich, France	199931
Infinicyt software version 1.8.0.e	Cytognos, Salamanca, Spain