Guiada por la base de datos-citometría de flujo para la evaluación de la maduración de células mieloides de la médula
Summary
La diagnosis MDS es difícil en ausencia de criterios morfológicos o citogenética no informativo. MFC podría ayudar a perfeccionar el proceso de diagnóstico de MDS. Para ser de utilidad para la práctica clínica, el análisis MFC debe basarse en parámetros con suficiente especificidad y sensibilidad, y resultados deben ser reproducibles entre diferentes operadores.
Abstract
Un grupo de trabajo iniciado dentro de la asociación francesa de citometría (AFC) fue desarrollado con el fin de armonizar la aplicación de la citometría de flujo multiparamétrico (MFC) para el diagnóstico de enfermedad mieloide en Francia. El protocolo presentado aquí fue acordada y aplicada entre septiembre de 2013 y noviembre de 2015 en seis laboratorios de diagnóstico francés (hospitales universitarios de Saint-Etienne, Grenoble, Clermont-Ferrand, Niza y Lille e Instituto Paoli-Calmettes en Marsella) y permite la estandarización de la médula ósea muestra preparación y adquisición de datos. Tres bases de datos de maduración fueron desarrollados para neutrófilos, monocítica y linajes eritroides con la médula ósea de individuos “sanos” donantes (personas sin ninguna evidencia de una enfermedad hematopoyética). Un método robusto de análisis para cada linaje mieloide debe ser aplicable para el uso rutinario de diagnóstico. Nuevos casos pueden ser analizados de la misma manera y con respecto a las bases de datos generalmente. Por lo tanto, cuantitativas y cualitativas las anormalidades fenotípicas pueden ser identificadas y aquellos por encima de 2SD en comparación con los datos de las muestras de médula ósea normal puede considerarse indicativas de patología. La principal limitación es la mayor variabilidad entre los datos que se consigue utilizando los anticuerpos monoclonales obtenidos con los métodos basados en hibridomas tecnologías y actualmente se utiliza en diagnóstico clínico. Establecimiento de criterios para la validación técnica de los datos adquiridos puede ayudar a mejorar la utilidad de MFC para el diagnóstico MDS. El establecimiento de estos criterios requiere un análisis contra una base de datos. La reducción de la subjetividad del investigador en análisis de datos es una ventaja importante de este método.
Introduction
En la ausencia de marcadores fenotípicos específicos a los que ocurren en las células mieloides durante la MDS iniciación y progresión de los cambios displásticos, ha propuesto un nuevo enfoque en los últimos años basadas en la evaluación de las vías de maduración (expresión alterada de antígenos mieloides durante la producción de células mieloides maduras) o de la distribución anormal de los diferentes tipos de células en la médula (BM) la célula compartimientos1,2.
Este artículo presenta un nuevo método para el uso estandarizado de MFC para detectar cambios displásticos en BM compartimentos de células mieloides relacionadas con síndromes mielodisplásicos (MDS) u otras enfermedades hematológicas mieloides. Este estudio también demuestra la utilidad del uso de bases de datos de maduración para el análisis de datos MFC.
Estandarización del procedimiento de preparación de muestras, adquisición de datos y análisis con las bases de datos permitiría la identificación de las anormalidades fenotípicas más relevantes relacionados con los cambios displásicos en células mieloides BM. Por lo tanto, son necesarios para el desarrollo de una estrategia de análisis que se puede utilizar en análisis posteriores subconjuntos estadísticamente seleccionados basados en formatos bien marcados y reconocidos (separador de población automático (APS) diagramas, histogramas y diagramas de punto) rondas. El descubrimiento de anormalidades fenotípicas robustos en MDS facilitaría el diagnóstico en casos con o sin displasia morfológica mínima y sin aberrancies citogenéticas. Identificación de parámetros discriminatorios lo que permite la reducción de paneles de immunophenotypic puede simplificar el actual puntuaciones2, permitiendo su aplicación en laboratorios de patología clínica.
Este método limita las interpretaciones subjetivas de datos de citometría, como se ha senalado en MDS diagnóstico3. Este paso es un requisito previo para el desarrollo de herramientas automáticas para el procesamiento y análisis de flujo de datos4.
MDS comprende un grupo heterogéneo de trastornos clonales de células madre hematopoyéticas (HSC) en el que las mutaciones del espliceosoma cooperan con modificadores epigenéticos específicos para producir el fenotipo MDS. Ahora se sabe que, junto con las mutaciones de la HSC, otros mecanismos están implicados en la fisiopatología MDS, como inflamación mediada inmune aberrante e interacciones entre HSCs malignas y el microambiente estromal del BM. Sin embargo, estos mecanismos siguen siendo mal entendidos. La heterogeneidad amplia clínica y biológica de los MDS hace el diagnóstico y la selección de la terapia óptima un desafío. En la última década, varios estudios han demostrado que MFC es a menudo más sensible en la detección de displasia2 de morfología, pero las limitaciones técnicas y económicas dificultan esta técnica estandarizar, con resultados a menudo depende de la experiencia del intérprete3. Además, no está claro cómo MFC puede inclinar la balanza hacia MDS en casos con o sin displasia morfológica mínima y en ausencia de anomalías citogenéticas o en casos extremos como hypocellular MDS, con una cuenta baja blast, de otros no clonal BM trastornos como la insuficiencia de la médula ósea (ej., anemia aplásica). También sigue siendo difícil de distinguir casos dudosos de MDS con un exceso de blastos de la leucemia mieloide aguda (AML). Por todas estas razones, las directrices clínicas integran no MFC de prueba en el diagnóstico final de MDS. En 2011, red nacional de cáncer integral de Estados Unidos (NCCN) recomendó MFC para la estimación del porcentaje de células CD34 +, detección de clones de la hemoglobinuria paroxística nocturna y la presencia de clones de células T citotóxicas en hypocellular MDS5. Estas dos últimas situaciones implican también un objetivo terapéutico porque los datos clínicos han demostrado una buena respuesta de estos pacientes a la terapia inmunosupresiva6. Las guías NCCN de 2017, citando las recomendaciones del grupo de trabajo internacional (GTI), la lista aberrante immunophenotyping detección MFC entre los co criterios para el diagnóstico de la MDS, pero sin realizar ninguna Especificaciones6. Además, la recientemente publicada clasificación de la OMS estipula que resultados MFC solamente no son suficientes para establecer un diagnóstico primario de MDS en ausencia de datos concluyentes de la morfológica y citogenética7. Sin embargo, MFC puede utilizarse como una prueba adicional que el dysregulation de células mieloides patrones de maduración y cuantificar la “distancia de normal” para un paciente en un momento específico en el curso de la enfermedad.
Este método es aplicable a los laboratorios clínicos interesados en la evaluación de la displasia de las células mieloides BM usando MFC immunophenotyping, para afinar el diagnóstico en MDS u otros desordenes mieloides con anormalidades displásticas.
Protocol
Representative Results
Discussion
La calidad de aspirado del BM podría impactar en los resultados finales. La hemodilución de la aspirada del BM podría distorsionar la distribución de células en diferentes etapas de maduración debido a la ausencia de progenitores o precursores. Probablemente emplear un bulto lisis método puede ayudar en la normalización de BM aspira por hemodilución en los análisis de citometría de flujo. Además, los pasos críticos para la evaluación de la displasia mieloide BM por citometría de flujo son la muestra proces…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los anticuerpos utilizados en este estudio fueron proporcionados por BD Biosciences. Los autores desean agradecer a su colega, el Dr. Pascale Flandrin-Gresta, desde el Departamento de Biología Molecular, laboratorio de Hematología, Universidad Hospital de Saint-Etienne, Francia, que proporciona conocimientos para la interpretación de datos NGS para la segunda Caso MDS. Los autores están agradecidos por los hematólogos del clínico para su interés y participación en este estudio y para los pacientes y donantes sanos para su acuerdo para participar en este estudio. Los autores quisieran agradecer a la Fundación “Les Amis de Rémi” apoyo financiero para la publicación.
Materials
| BD FACSCanto II flow-cytometer | BD Biosciences, CA, USA | SN: V33896301336 | 3-laser, 4-2-2 configuration, Filters and mirrors details: https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCanto_II_FilterGuide.pdf |
| Awel C48-R Centrifuge | AWEL Industries, FR | SN: 910120016; Model No: 320002001 | low speed centrifuges; capacity 60 FACS tubes |
| Pipetts of 10µl and 200µl | |||
| Pasteur pipettes | |||
| 15 mL Falcon tubes | |||
| polypropylene tube for FACS | |||
| Mouse Anti-Human HLA-DR | BD Biosciences, CA, USA | 655874 | clone L243 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome Horizon V450 (Ex max 404 nm/ Em max 448 nm) |
| Mouse Anti-Human CD45 | BD Biosciences, CA, USA | 560777 | clone HI30 Mouse IgG1, κ Fluorochrome Horizon V500 (Ex max 415 nm/ Em max 500 nm) |
| Mouse Anti-Human CD16 | BD Biosciences, CA, USA | 656146 | clone CLB/fcGran1 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm) |
| Mouse Anti-Human CD13 | BD Biosciences, CA, USA | 347406 | clone L138 Mouse BALB/c X C57BL/6 IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
| Mouse Anti-Human CD34 | BD Biosciences, CA, USA | 347222 | clone 8G12 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PerCP-Cy5.5 (Ex max 482 nm/ Em max 678 nm) |
| Mouse Anti-Human CD117 | BD Biosciences, CA, USA | 339217 | clone 104D2 Mouse BALB/c IgG1 Fluorochrome PE-Cy7 (Ex max 496 nm/ Em max 785 nm) |
| Mouse Anti-Human CD11b | BD Biosciences, CA, USA | 333143 | clone D12 Mouse BALB/c IgG2a, κ D12, Fluorochrome APC (Ex max 650 nm/ Em max 660nm |
| Mouse Anti-Human CD10 | BD Biosciences, CA, USA | 646783 | clone HI10A Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm) |
| Mouse Anti-Human CD35 | BD Biosciences, CA, USA | 555452 | clone E11 Mouse IgG1, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm) |
| Mouse Anti-Human CD64 | BD Biosciences, CA, USA | 644385 | clone 10.1 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
| Mouse Anti-Human CD300e | Immunostep | IREM2A-T100 | clone UP-H2 Mouse BALB/c IgG1, k Fluorochrome APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
| Mouse Anti-Human CD14 | BD Biosciences, CA, USA | 641394 | clone MoP9 Mouse BALB/c IgG2b, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm) |
| Mouse Anti-Human CD36 | BD Biosciences, CA, USA | 656151 | clone CLB-IVC7 Mouse IgG1, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm) |
| Mouse Anti-Human CD105 | BD Biosciences, CA, USA | 560839 | clone 266 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
| Mouse Anti-Human CD33 | 345800 | clone P67.6 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
|
| Mouse Anti-Human CD71 | BD Biosciences, CA, USA | 655408 | clone M-A712 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm) |
| Lysing Solution 10X Concentrate (IVD) | BD Biosciences, CA, USA | 349202 | |
| FACSFlow Sheath Fluid | BD Biosciences, CA, USA | 342003 | |
| FACSDiva CS&T IVD beads | BD Biosciences, CA, USA | 656046 | |
| RAINBOW CALIBRATION PARTICLES, 8 PEAKS | Cytognos, Salamanca, Spain | SPH-RCP-30-5A | lots EAB01, EAC01, EAD05, EAE01, EAF01, EAG01, EAH01, EAI01, EAJ01, EAK01 |
| Compensation Particles Multicolor CompBeads(CE/IVD) | BD Biosciences, CA, USA | ref. #51-90-9001229 + #51-90-9001291 | |
| Diva software versions 6.1.2 and 6.1.3 | BD Biosciences, CA, USA | ||
| Phosphate buffered saline tablets | R&D Systems, Minneapolis, USA | 5564 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, France | A9647 | |
| Sodium azide 99% | Sigma-Aldrich, France | 199931 | |
| Infinicyt software version 1.8.0.e | Cytognos, Salamanca, Spain |
References
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