Datenbank-geführte Durchflusszytometrie zur Auswertung von Knochenmark myeloische Zellen Reifung
Summary
Die MDS-Diagnose ist schwierig bei fehlender morphologischer Kriterien oder nicht-informativen Zytogenetik. MFC könnte dazu beitragen, den MDS diagnostischen Prozess zu verfeinern. Nützlich für die klinische Praxis zu werden, die MFC-Analyse muss auf Parametern beruhen mit ausreichender Spezifität und Sensitivität und Daten sollten zwischen verschiedenen Betreibern reproduzierbar sein.
Abstract
Eine Arbeitsgruppe innerhalb der französischen Zytometrie Verband (AFC) initiiert wurde entwickelt, um die Anwendung der multiparameter Durchflusszytometrie (MFC) in Einklang zu bringen für die myeloischen Krankheit Diagnose in Frankreich. Die hier vorgestellten Protokoll war vereinbarten und angewandte September 2013 bis November 2015 in sechs französischen diagnostische Laboratorien (Universitätskliniken von Saint-Etienne, Grenoble, Clermont-Ferrand, Nizza, und Lille und Institut Paoli-Calmettes in Marseille) und erlaubt die Standardisierung von Knochenmark Probe Vorbereitung und Datenerfassung. Für Neutrophilen, monozytären, und erythroiden Linien mit Knochenmark von “gesunden” Spenders Einzelpersonen (Individuen ohne Nachweis einer hämatopoetischen Krankheit) wurden drei Reifung Datenbanken entwickelt. Eine robuste Methode zur Analyse für jedes myeloid Abstammung sollte für den Routineeinsatz diagnostische Anwendung finden. Neuerkrankungen können auf die gleiche Weise analysiert und mit den üblichen Datenbanken verglichen. So, quantitative und qualitative phänotypische Anomalien identifiziert werden können und den oben genannten 2SD im Vergleich mit Daten des normalen Knochenmarkproben gezogen werden bezeichnend für Pathologie. Die größte Beschränkung ist die höhere Variabilität zwischen den Daten mit Hilfe der monoklonale Antikörper erhalten mit den Methoden basieren auf Hybridom-Technologien und derzeit in der klinischen Diagnostik eingesetzt. Festlegung von Kriterien für technische Validierung der gewonnenen Daten kann dazu beitragen das MFC-Dienstprogramm für die MDS-Diagnostik. Die Festlegung dieser Kriterien erfordert eine Analyse anhand einer Datenbank. Die Reduzierung der Ermittler Subjektivität in der Datenanalyse ist ein wichtiger Vorteil dieser Methode.
Introduction
In Ermangelung der phänotypischen Marker speziell für die dysplastischen Veränderungen in myeloische Zellen während MDS Initiation und Progression schlägt ein neuer Ansatz in den letzten Jahren, basierend auf der Auswertung der Reifung Bahnen (veränderte Expression von myeloische Antigene bei der Herstellung von Reifen myeloische Zellen) oder abnorme Verteilung der verschiedenen Zelltypen im Knochenmark (BM) Zelle Fächer1,2.
Dieser Artikel stellt eine neue Methode für standardisierte Anwendung von MFC um dysplastische Veränderungen in BM myeloische Zellen Fächer im Zusammenhang mit myelodysplastischen Syndromen (MDS) oder anderen myeloischen hämatologischen Krankheiten zu erkennen. Diese Studie zeigt auch das Dienstprogramm Reifung Datenbanken für MFC Datenanalyse zu verwenden.
Standardisierung der Vorbereitung Beispielprozedur, Datenerfassung und Analyse mit den Datenbanken würde es der relevantesten phänotypischen Anomalien im Zusammenhang mit dysplastische Veränderungen in BM myeloische Zellen ermöglichen. Daher sind statistisch ausgewählte Teilmengen basierend auf gut beschriftet und anerkannter Formaten (automatische Bevölkerung Separator (APS) Diagramme, Histogramme und Punkt plottet) erforderlich für die Entwicklung einer Strategie-Analyse, die in der nachfolgenden Analyse verwendet werden können Runden. Die Entdeckung der robuste phänotypischen Anomalien bei MDS würde in Fällen mit oder ohne minimale morphologische Dysplasie und zytogenetische Aberrancies die Diagnose erleichtern. Identifikation der diskriminierenden Parameter ermöglicht die Reduzierung der Immunophenotypic Platten kann die aktuelle Resultate2, deren Anwendbarkeit im klinischen Pathologie-Labor bei schönem vereinfachen.
Diese Methode schränkt die subjektiven Interpretationen der Zytometrie Daten, wie in MDS Diagnose3signalisiert worden. Dieser Schritt ist eine Voraussetzung für die Entwicklung von automatisierten Tools für die Verarbeitung und Analyse fließen Daten4.
MDS umfasst eine heterogene Gruppe von klonalen hämatopoetischen Stammzellen (HSC) Störungen in denen Spliceosome Mutationen mit spezifische epigenetische Modifikatoren den MDS-Phänotyp Ausbeute Zusammenwirken. Es ist nun bekannt, dass zusammen mit HSC Mutationen, MDS Pathophysiologie, z. B. abweichende immunvermittelte Entzündung und Wechselwirkungen zwischen malignen HSCs und die stromale Mikroumgebung des BM andere Mechanismen beteiligt sind. Diese Mechanismen bleiben jedoch schlecht verstanden. Die breite klinische und biologische Heterogenität der MDS macht die Diagnose und die Wahl der optimalen Therapie zu einer Herausforderung. In den letzten zehn Jahren mehrere Studien haben gezeigt, dass MFC oft mehr empfindlich bei der Aufdeckung von Dysplasie2 als Morphologie, aber technische und wirtschaftliche Abhängigkeiten erschweren diese Technik zu standardisieren, mit Ergebnissen oft abhängig von der Erfahrung der Dolmetscher3. Darüber hinaus ist unklar, wie MFC kann Zünglein an der Waage in Richtung MDS in Fällen mit oder ohne minimale morphologische Dysplasie und fehlender zytogenetischer Anomalien oder in Grenzfällen wie Hypocellular MDS, mit einer niedrigen Explosion zählen, von anderen nicht-klonale BM Störungen wie Knochenmarkdepression (i.e., aplastische Anämie). Es bleibt auch schwierige Grenzfälle des MDS mit einem Überschuss von Blasten von akuter myeloischer Leukämie (AML) zu unterscheiden. Aus all diesen Gründen integrieren MFC Tests in die endgültige Diagnose MDS nicht die klinischen Leitlinien. Im Jahr 2011 empfohlen die US nationale umfassende Krebs Network (NCCN) MFC für die Schätzung von den Prozentsatz von CD34 + Zellen, Erkennung von paroxysmale nächtliche Hämoglobinurie Klone und Vorhandensein von zytotoxischen T-Zell-Klone in Hypocellular MDB-5. Diesen beiden letzteren Fällen beinhalten auch ein therapeutisches Ziel, da klinische Daten haben eine gute Reaktion der Patienten auf immunsuppressive Therapie6gezeigt. Die 2017 NCCN-Richtlinien, unter Berufung auf die internationalen arbeiten Group (IWG) Empfehlungen aufgeführt aberranten Immunphänotypisierung Erkennung von MFC zu den KO Kriterien für MDS-Diagnose, ohne jedoch irgendwelche Spezifikationen-6. Außerdem legt die kürzlich veröffentlichte WHO-Klassifikation, dass MFC Erkenntnisse allein nicht ausreichen, Primärdiagnose von MDS bei fehlender schlüssigen morphologischen und/oder zytogenetische Daten7zu etablieren. MFC ist jedoch als ein zusätzlicher Test zeigt die Dysregulation der myeloischen Zellen Reifung Muster und Quantifizierung den “Abstand von” normal “” für einen Patienten zu einem bestimmten Zeitpunkt im Krankheitsverlauf einsetzbar.
Diese Methode ist anwendbar bei klinischen Labors interessiert bei der Bewertung der Dysplasie bei BM myeloische Zellen unter Verwendung von MFC Immunphänotypisierung, um die Diagnose MDS oder anderen myeloischen Erkrankungen mit dysplastischen Anomalien zu verfeinern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Qualität der BM Aspirat könnte auf das Endergebnis auswirken. Die Polopiryna der BM-Aspirat könnte die Verteilung der Zellen in verschiedenen Stadien der Reifung aufgrund des Fehlens von Vorfahren oder Vorstufen verfälschen. Normalisierung der BM Aspiraten für Polopiryna im Fluss durchflusszytometrischen Analyse kann helfen, wahrscheinlich einen Großteil Lyse Methode beschäftigt. Darüber hinaus sind die entscheidenden Schritte zur Bewertung von BM myeloische Dysplasie durch Durchflusszytometrie die Probe Vera…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
In dieser Studie verwendeten Antikörper wurden von BD Biosciences bereitgestellt. Die Autoren möchte ihre Kollegin Dr. Pascale Flandrin-Gresta, vom Department of Molecular Biology, Hämatologie-Labor, Universität Krankenhaus Saint-Etienne, Frankreich, versorgte sie mit Fachwissen für die Interpretation der NGS-Daten für die zweite MDS-Fall. Die Autoren sind dankbar für die Kliniker Hämatologen für ihr Interesse und ihre Beteiligung an dieser Studie auch für die Patienten und gesunden Spendern für ihre Zustimmung zur Teilnahme an dieser Studie. Die Autoren möchte auch die “Les Amis de Rémi” Stiftung für finanzielle Unterstützung für die Veröffentlichung zu danken.
Materials
| BD FACSCanto II flow-cytometer | BD Biosciences, CA, USA | SN: V33896301336 | 3-laser, 4-2-2 configuration, Filters and mirrors details: https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCanto_II_FilterGuide.pdf |
| Awel C48-R Centrifuge | AWEL Industries, FR | SN: 910120016; Model No: 320002001 | low speed centrifuges; capacity 60 FACS tubes |
| Pipetts of 10µl and 200µl | |||
| Pasteur pipettes | |||
| 15 mL Falcon tubes | |||
| polypropylene tube for FACS | |||
| Mouse Anti-Human HLA-DR | BD Biosciences, CA, USA | 655874 | clone L243 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome Horizon V450 (Ex max 404 nm/ Em max 448 nm) |
| Mouse Anti-Human CD45 | BD Biosciences, CA, USA | 560777 | clone HI30 Mouse IgG1, κ Fluorochrome Horizon V500 (Ex max 415 nm/ Em max 500 nm) |
| Mouse Anti-Human CD16 | BD Biosciences, CA, USA | 656146 | clone CLB/fcGran1 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm) |
| Mouse Anti-Human CD13 | BD Biosciences, CA, USA | 347406 | clone L138 Mouse BALB/c X C57BL/6 IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
| Mouse Anti-Human CD34 | BD Biosciences, CA, USA | 347222 | clone 8G12 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PerCP-Cy5.5 (Ex max 482 nm/ Em max 678 nm) |
| Mouse Anti-Human CD117 | BD Biosciences, CA, USA | 339217 | clone 104D2 Mouse BALB/c IgG1 Fluorochrome PE-Cy7 (Ex max 496 nm/ Em max 785 nm) |
| Mouse Anti-Human CD11b | BD Biosciences, CA, USA | 333143 | clone D12 Mouse BALB/c IgG2a, κ D12, Fluorochrome APC (Ex max 650 nm/ Em max 660nm |
| Mouse Anti-Human CD10 | BD Biosciences, CA, USA | 646783 | clone HI10A Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm) |
| Mouse Anti-Human CD35 | BD Biosciences, CA, USA | 555452 | clone E11 Mouse IgG1, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm) |
| Mouse Anti-Human CD64 | BD Biosciences, CA, USA | 644385 | clone 10.1 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
| Mouse Anti-Human CD300e | Immunostep | IREM2A-T100 | clone UP-H2 Mouse BALB/c IgG1, k Fluorochrome APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
| Mouse Anti-Human CD14 | BD Biosciences, CA, USA | 641394 | clone MoP9 Mouse BALB/c IgG2b, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm) |
| Mouse Anti-Human CD36 | BD Biosciences, CA, USA | 656151 | clone CLB-IVC7 Mouse IgG1, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm) |
| Mouse Anti-Human CD105 | BD Biosciences, CA, USA | 560839 | clone 266 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
| Mouse Anti-Human CD33 | 345800 | clone P67.6 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
|
| Mouse Anti-Human CD71 | BD Biosciences, CA, USA | 655408 | clone M-A712 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm) |
| Lysing Solution 10X Concentrate (IVD) | BD Biosciences, CA, USA | 349202 | |
| FACSFlow Sheath Fluid | BD Biosciences, CA, USA | 342003 | |
| FACSDiva CS&T IVD beads | BD Biosciences, CA, USA | 656046 | |
| RAINBOW CALIBRATION PARTICLES, 8 PEAKS | Cytognos, Salamanca, Spain | SPH-RCP-30-5A | lots EAB01, EAC01, EAD05, EAE01, EAF01, EAG01, EAH01, EAI01, EAJ01, EAK01 |
| Compensation Particles Multicolor CompBeads(CE/IVD) | BD Biosciences, CA, USA | ref. #51-90-9001229 + #51-90-9001291 | |
| Diva software versions 6.1.2 and 6.1.3 | BD Biosciences, CA, USA | ||
| Phosphate buffered saline tablets | R&D Systems, Minneapolis, USA | 5564 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, France | A9647 | |
| Sodium azide 99% | Sigma-Aldrich, France | 199931 | |
| Infinicyt software version 1.8.0.e | Cytognos, Salamanca, Spain |
References
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