데이터베이스 가이드-cytometry 골 골수성 세포 성숙의 평가 위한
Summary
MDS 진단 기준 형태학 또는 비 유익한 세포 유전학의 부재에 어렵습니다. MFC는 MDS 진단 과정을 구체화 도움이 될. 임상 연습에 유용 될, MFC 분석 기반으로 해야 합니다 매개 변수 충분 한 특이성 및 감도, 그리고 데이터 다른 연산자 사이 재현 되어야 합니다.
Abstract
프랑스 Cytometry 협회 (AFC)에서 시작 하는 작업 그룹 프랑스에서 골수성 질환 진단을 위한 multiparameter cytometry (MFC) 응용 프로그램을 조화 하기 위하여 개발 되었다. 여기에 제시 된 프로토콜 6 프랑스 진단 실험실 (대학 병원의 세인트 에티엔느, 그 르노 블, 클레르몽페랑, 니스, 그리고 릴과 인 바울은 Calmettes에 합의 하 고 2013 년 9 월과 11 월 2015 사이의 적용 했다 마르세유) 골 수 샘플 준비 및 데이터 수집의 표준화를 허용. 3 성숙 데이터베이스 neutrophil, monocytic, 및 erythroid 계보 골 수 기증자가 “건강 한” 개인 (개인 조 혈 질환의 증거 없이)에서 함께 개발 되었다. 각 골수성 혈통에 대 한 분석의 강력한 방법 일상적인 진단 사용 하기 위해 적용 해야 합니다. 새로운 경우 동일한 방식으로 분석 하 고 일반적인 데이터베이스와 비교 수 있습니다. 따라서, 양적 및 질적 phenotypic 이상이 확인 될 수 있다 고 정상적인 골 수 샘플의 데이터와 비교 하는 2SD 위에 병 리의 지표로 고려 되어야 한다. 주요 제한은 hybridoma 기술에 기반 하 고 현재 임상 진단에 사용 되는 방법으로 얻은 단일 클론 항 체를 사용 하 여 달성 하는 데이터 간의 높은 가변성입니다. 데이터 취득 기술 유효성 검사에 대 한 기준을 설정 MDS 진단에 대 한 MFC의 유틸리티를 개선할 수 있습니다. 이러한 기준의 설립 데이터베이스에 대 한 분석을 요구 한다. 데이터 분석에서 조사 주관의 감소는이 방법의 중요 한 장점입니다.
Introduction
Phenotypic 마커 골수성 세포에서 발생 하는 MDS 개시 및 진행 하는 동안 dysplastic 변화에 특정의 부재, 새로운 접근의 성숙 경로 (변경 된 식의 평가에 따라 최근 몇 년 동안에서 제안 되었습니다. 성숙한 골수성 세포의 생산 동안 골수성 항) 또는 다른 종류의 세포 골 수 (BM) 내에서 비정상적인 분포의 세포 구획1,2.
이 문서는 BM 골수성 세포 구획 형성 증후군 (MDS) 또는 다른 골수성 혈액 질병에 관련 된에서 dysplastic 변화를 감지 하기 위해 MFC의 표준화 된 응용 프로그램에 대 한 새 메서드를 제공 합니다. 이 연구는 또한 성숙 데이터베이스를 사용 하 여 MFC 데이터 분석에 대 한 유틸리티를 보여 줍니다.
샘플 준비 절차, 데이터 수집, 데이터베이스를 사용 하 여 분석의 표준화 관련 BM 골수성 세포에서 dysplastic 변화에 가장 관련성이 높은 phenotypic 이상 식별을 수 있습니다. 따라서, 잘 분류 하 고 잘 인식 형식 (자동 인구 구분 (AP) 다이어그램, 히스토그램, 점 작)에 따라 통계적으로 선택한 하위 집합은 이후 분석에 사용할 수 있는 분석 전략 개발에 필요한 반올림합니다. MDS에서 강력한 phenotypic 이상이 발견 경우에 함께 또는 최소한의 형태 발육 이상 없이 cytogenetic aberrancies 없이 진단을 쉽게 것 이다. 차별 매개 변수 immunophenotypic 패널의 감소에 대 한 허용의 현재 점수2, 임상 병 리 실험실에서 그들의 적용을 허용 단순화할 수 있습니다.
이 방법으로 MDS 진단3신호 cytometry 데이터의 주관적인 해석을 제한 합니다. 이 단계는 처리 흐름 데이터4를 분석 하기 위한 자동화 도구 개발을 위한 전제 조건입니다.
MDS에 있는 spliceosome 돌연변이를 MDS 형 특정 epigenetic 한정자와 협력 하는 클론 조 혈 줄기 세포 (HSC) 무질서의 이질적인 그룹으로 구성 됩니다. 그것은 지금, HSC 돌연변이, 함께 다른 메커니즘 MDS 이상, 정도 벗어난 면역 중재 염증 등 악성 HSCs는 BM의 실질 microenvironment 사이 상호 작용에에서 관련 된 알려져 있다. 그러나, 이러한 메커니즘 제대로 이해 남아 있다. MDS의 넓은 임상과 생물학이 도전 진단과 최적의 치료의 선택은. 지난 10 년간에서 여러 연구 MFC는 종종 더 많은 형태, 기술적, 경제적 제약 보다 발육 이상2 감지에 민감한 어렵게이 기술을 표준화, 결과 따라 자주 하는 3통역 경험입니다. 또한, 그것은 불분명 얼마나 MFC는 다른 비 클론 BM에서 경우 또는 최소한의 형태 발육 이상 없이 및 cytogenetic 변칙의 부재 또는 hypocellular MDS, 낮은 폭발 카운트와 같은 경계선 경우 MDS 향해 균형 팁 수 있습니다. 골 수 오류 장애 (즉., aplastic 빈 혈). 그것은 또한 급성 골수성 백혈병 (AML) 폭발의 초과 MDS의 경계선 경우를 구분 하기 어려운 남아 있다. 모든 이러한 이유로, MFC 테스트 MDS 최종 진단에 임상 지침 통합 하지 않습니다. 2011 년에 미국 국립 종합 암 네트워크 (NCCN) CD34 + 세포의 비율, 발작 야행성 hemoglobinuria 클론의 검색 및 hypocellular MDS5에서 세포 독성 T 세포 클론의 존재의 추정에 대 한 MFC를 권장. 이러한 두 가지 후자의 경우는 또한 임상 데이터 면역 치료6이러한 환자 들의 좋은 반응을 보여왔다 때문에 치료 목표를 포함 한다. 국제 작업 그룹 (IWG) 권고를 인용 2017 NCCN 가이드라인, 나열 MDS 진단 하지만 모든 사양6하지 않고 공동 기준 사이에서 MFC에 의해 탈 선 immunophenotyping 탐지. 또한, 최근 발표 된 WHO 분류 규정 MFC 결과 혼자 결정적인 형태학 및 cytogenetic 데이터7의 부재에서 MDS의 기본 진단 설정 충분 하지 않습니다. 그러나 MFC 골수성 세포의 dysregulation 성숙 패턴을 보여주는 고 질병 과정에서 특정 시간에 환자에 대 한 정상에서 “거리”를 측정 하는 추가 테스트로 사용할 수 있습니다.
이 방법은 MFC immunophenotyping를 사용 하 여 MDS 또는 dysplastic 이상으로 다른 골수성 질환에서 진단 구체화 BM 골수성 세포에서 형성 평가에 관심이 있는 임상 실험실에서 적용 됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
BM aspirate의 품질 최종 결과에 영향을 줄 수 있습니다. BM aspirate의 hemodilution 창시자의 부재로 인해 성숙의 다른 단계에 있는 세포 또는 선구자 세포의 분포를 왜곡 수 있습니다. 아마 채용 방법 lysing 대량 흐름 cytometric 분석에서 hemodilution에 대 한 BM aspirates의 정상화에 도움이 됩니다. 또한, cytometry 의해 BM 골수성 dysplasia의 평가 위한 중요 한 단계는 샘플 처리 및 얼룩, 데이터 수집 및 해석<sup class="xre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구에 사용 된 항 체는 BD 생물 과학에 의해 제공 되었다. 저자는 그들의 동료, 박사 Pascale Flandrin-Gresta에서 부의 분자 생물학, 혈액학 연구소, 대학 병원의 세인트 에티엔느, 프랑스, NGS 데이터의 두 번째에 대 한 해석에 대 한 전문성을 제공 감사 하 고 싶습니다. MDS의 경우입니다. 저자는이 연구에 참여 하도록 그들의 계약에 대 한 건강 한 기증자와 환자에 대 한 그들의 관심과이 연구에 참여 한 임상 hematologists에 대 한 감사. 저자는 또한 간행물에 대 한 재정 지원에 대 한 “Les Amis de 레미” 재단을 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| BD FACSCanto II flow-cytometer | BD Biosciences, CA, USA | SN: V33896301336 | 3-laser, 4-2-2 configuration, Filters and mirrors details: https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCanto_II_FilterGuide.pdf |
| Awel C48-R Centrifuge | AWEL Industries, FR | SN: 910120016; Model No: 320002001 | low speed centrifuges; capacity 60 FACS tubes |
| Pipetts of 10µl and 200µl | |||
| Pasteur pipettes | |||
| 15 mL Falcon tubes | |||
| polypropylene tube for FACS | |||
| Mouse Anti-Human HLA-DR | BD Biosciences, CA, USA | 655874 | clone L243 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome Horizon V450 (Ex max 404 nm/ Em max 448 nm) |
| Mouse Anti-Human CD45 | BD Biosciences, CA, USA | 560777 | clone HI30 Mouse IgG1, κ Fluorochrome Horizon V500 (Ex max 415 nm/ Em max 500 nm) |
| Mouse Anti-Human CD16 | BD Biosciences, CA, USA | 656146 | clone CLB/fcGran1 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm) |
| Mouse Anti-Human CD13 | BD Biosciences, CA, USA | 347406 | clone L138 Mouse BALB/c X C57BL/6 IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
| Mouse Anti-Human CD34 | BD Biosciences, CA, USA | 347222 | clone 8G12 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PerCP-Cy5.5 (Ex max 482 nm/ Em max 678 nm) |
| Mouse Anti-Human CD117 | BD Biosciences, CA, USA | 339217 | clone 104D2 Mouse BALB/c IgG1 Fluorochrome PE-Cy7 (Ex max 496 nm/ Em max 785 nm) |
| Mouse Anti-Human CD11b | BD Biosciences, CA, USA | 333143 | clone D12 Mouse BALB/c IgG2a, κ D12, Fluorochrome APC (Ex max 650 nm/ Em max 660nm |
| Mouse Anti-Human CD10 | BD Biosciences, CA, USA | 646783 | clone HI10A Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm) |
| Mouse Anti-Human CD35 | BD Biosciences, CA, USA | 555452 | clone E11 Mouse IgG1, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm) |
| Mouse Anti-Human CD64 | BD Biosciences, CA, USA | 644385 | clone 10.1 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
| Mouse Anti-Human CD300e | Immunostep | IREM2A-T100 | clone UP-H2 Mouse BALB/c IgG1, k Fluorochrome APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
| Mouse Anti-Human CD14 | BD Biosciences, CA, USA | 641394 | clone MoP9 Mouse BALB/c IgG2b, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm) |
| Mouse Anti-Human CD36 | BD Biosciences, CA, USA | 656151 | clone CLB-IVC7 Mouse IgG1, κ Fluorochrome FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm) |
| Mouse Anti-Human CD105 | BD Biosciences, CA, USA | 560839 | clone 266 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
| Mouse Anti-Human CD33 | 345800 | clone P67.6 Mouse BALB/c IgG1, κ Fluorochrome APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm) |
|
| Mouse Anti-Human CD71 | BD Biosciences, CA, USA | 655408 | clone M-A712 Mouse BALB/c IgG2a, κ Fluorochrome APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm) |
| Lysing Solution 10X Concentrate (IVD) | BD Biosciences, CA, USA | 349202 | |
| FACSFlow Sheath Fluid | BD Biosciences, CA, USA | 342003 | |
| FACSDiva CS&T IVD beads | BD Biosciences, CA, USA | 656046 | |
| RAINBOW CALIBRATION PARTICLES, 8 PEAKS | Cytognos, Salamanca, Spain | SPH-RCP-30-5A | lots EAB01, EAC01, EAD05, EAE01, EAF01, EAG01, EAH01, EAI01, EAJ01, EAK01 |
| Compensation Particles Multicolor CompBeads(CE/IVD) | BD Biosciences, CA, USA | ref. #51-90-9001229 + #51-90-9001291 | |
| Diva software versions 6.1.2 and 6.1.3 | BD Biosciences, CA, USA | ||
| Phosphate buffered saline tablets | R&D Systems, Minneapolis, USA | 5564 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, France | A9647 | |
| Sodium azide 99% | Sigma-Aldrich, France | 199931 | |
| Infinicyt software version 1.8.0.e | Cytognos, Salamanca, Spain |
References
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